基于EST-SSR标记的西双版纳苦茶资源遗传多样性分析

尚卫琼，李友勇，刘悦，段志芬，杨盛美，李慧，许燕，刘本英

（云南省农业科学院茶叶研究所，云南省茶学重点实验室，云南省茶树种质资源创新与配套栽培技术工程研究中心，云南昆明666201）

云南作为茶树的原产地，具有丰富的茶树种质资源。在茶树种质资源收集方面，云南现在共收集保存有茶组植物31个种和2个变种，而其中作为云南特有的就有21个种[1]。张宏达[2]将茶组植物分为4个系：五室茶系、五柱茶系、秃房茶系和茶系。目前，西双版纳茶组植物共有3个系，7个种和2个变种，其中以普洱茶种（Camellia assamica）分布最广，而苦茶（Camellia assamica var.kucha）作为其中的一个变种，经过长期的演化，其脂型儿茶素的含量远远高于非脂型儿茶素的含量，在制作发酵程度较高的茶类中表现出很高的优势，蕴含着抵抗各种逆境所需要的基因，是茶树品种中的宝贵资源。另一方面，苦茶种质资源在西双版纳傣族自治州境内有大面积分布，主要集中在勐海县布朗山、景洪市勐龙镇和勐腊县易武镇一带。而由于西双版纳地貌多为中低山和丘陵区，茶区位置偏僻，交通不便，前人对优异茶树种质资源的收集多集中于地方种质的收集，极大地限制了茶树遗传多样性种质资源的研究和育种材料创制，有大量的茶树资源未开展系统鉴定。

在分子鉴定方面，虽然前人对云南大叶茶资源进行了大量的研究[3-8]，但针对苦茶种质资源的研究鲜有报道，导致一些苦茶资源优良品种还没有得到充分的开发和利用。EST-SSR技术具有成本低、通用性好、条带清晰、带形容易统计等优点，在茶树遗传多样性、指纹图谱、分子鉴别等研究上得到了很好的应用，是一种非常有效、可靠的分子技术[9-10]。

本研究通过利用28对SSR引物对西双版纳傣族自治州境内的50份苦茶种质资源进行EST-SSR分子标记方法遗传多样性和亲缘关系分析，旨在初步探索西双版纳州境内苦茶种质资源的多样性，为后期的优良种质资源收集、保护和利用提供科学参考。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料共50份，分别来源于西双版纳傣族自治州景洪市勐龙镇、勐海县布朗山乡和勐腊县3个地区，其中，有23份采自景洪市勐龙镇勐宋乡曼迈瑶村民小组，海拔1 650～1 780 m，样品编号1～23号；15份采自勐海县布朗山乡老曼峨村，海拔1 650 m左右，样品编号24～38号；12份采自勐腊县瑶区南贡山，海拔1 470 m左右，样品编号39～50号。利用硅胶对苦茶样的新梢一芽二叶进行干燥处理，制成试验样品，并记录样品信息、编号，保存备用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取将各份试验材料分别进行打样磨碎，采用改良的CTAB法[11]提取基因组DNA，利用0.8%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000分光光度计测定DNA的纯度和浓度，稀释至20 ng/μL，-20℃保存备用。

1.2.2 SSR引物及PCR扩增将28对SSR引物用于样品材料的扩增，其序列参照文献[12]。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR扩增反应在PTC-200型PCR仪上进行，反应体系为10μL，包括上下游引物各0.2μL，10×Buffer（Mg2+）1μL，dNTP 0.2μL，Taq酶0.5 U，加ddH2O至10μL。PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，50～65℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃最终延伸10 min，4℃保存。PCR产物采用10%聚丙烯酰胺凝胶在电泳仪上进行电泳检测，电压170 V，时间120 min。银染显色，使用凝胶成像仪拍照记录。

1.3 数据处理

电泳图上的条带处理参照张成才等[13]的方法进行，将电泳图上的条带由大到小按照A、B、C、D、E等依次赋值，缺失条带以“-”表示，统计样品材料的基因型。28对引物中的SSR07引物和SSR19引物扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱如图1所示。

使用Popgene软件计算每对引物的等位位点数、观测杂合度、期望杂合度、等位基因频率、基因型数和遗传距离等，通过PIC-CALC 0.6计算各位点的多态性信息含量，按UPGMA软件绘制聚类图[14]，分析其遗传多样性。

2 结果与分析

2.1 不同来源苦茶资源的遗传多样性分析

由表1可知，28对SSR引物在50个个体中共检测出127个等位基因，每个位点扩增出的等位基因数为3～6个，平均每个位点为4.53；Shannon信息指数为0.92～1.70，最小为SSR01位点（0.92），最大为SSR09位点（1.70），平均每个位点为1.25，除SSR01、SSR02和SSR17这3个位点的Shannon信息指数小于1外，其他位点都大于1；观测杂合度数值为0.404～1.000，最小为SSR09位点（0.404），最大为SSR23位点（1.000），平均为0.709；期望杂合度数值为0.506～0.814，最小为SSR01位点（0.506），最大为SSR09位点（0.814），平均为0.676；多态性信息含量数值为0.444～0.777，最小为SSR01位点（0.444），最大为SSR09位点（0.777），平均为0.614。SSR17位点的等位基因数为3个，具有较低的遗传重要性，而SSR07、SSR09这2个位点的等位基因数均为6个，说明在群体遗传结构中具有较高的重要性。位点SSR01（0.444）、SSR02（0.476）和SSR24（0.499）的多态性信息含量在0.25～0.50，这3个位点表现为中度的遗传多样性，其他25个位点都大于0.5，表现为高度遗传多样性，表明50份供试的西双版纳苦茶资源材料具有丰富的遗传多样性。

表1 28个SSR位点的遗传多样性信息参数

2.2 不同来源苦茶资源的遗传分化分析

表2 材料来源地间的遗传分化

续表2

对50份西双版纳苦茶材料的不同来源地间遗传分化进行分析，结果如表2所示，同一来源地内基因多样性平均值为-1，且全部引物均为-1，表现为杂合体偏高；不同来源地间遗传分化系数平均为0.803 8，表明80.38%的遗传分化系数存在于材料不同来源地间；材料不同来源地间基因流平均为0.061 0，基因流较大，说明不同来源地间基因交流程度很高，表明本试验中50份苦茶材料的遗传变异多样性主要是由不同来源地之间产生的。

2.3 聚类图与遗传多样性分析

50份供试材料基于Nei's遗传距离构建的UPGMA聚类图如图2所示，在大类群中，将50份苦茶资源材料分为四大类，其中，17号和22号、1号和2号各2份材料分别单独聚为一个大类，其他的46份材料则分散分布于聚类图中，形成2个大类。各2份供试材料均具有较大的遗传距离和较低的遗传相似度，5号和12号的遗传距离最小，为0.37，相似度为0.690 8；6号和21号的遗传距离（0.458 1）次之，相似度为0.632 5；19号和25号的遗传距离为0.556 6，相似度为0.573 2。从整个遗传聚类图来看，聚类结果与多态性信息含量等参数值分析结果一致，表现出丰富的遗传多样性。

3 结论与讨论

西双版纳苦茶资源作为一种特异资源具有重要的研究价值和利用潜力。多态性信息含量作为茶树资源的遗传多样性重要指标，小于0.25时位点表现为低度多态性，大于0.25小于0.50时为中度多态性，大于0.50时为高度多态性。本研究通过利用28对SSR引物对西双版纳傣族自治州境内的50份苦茶资源进行遗传多样性分析，结果得出，其多态性信息含量为0.444～0.777，25对引物表现高度多态性，说明作为供试材料的50份苦茶资源具有丰富的遗传多样性。李丹等[15]利用ISSR分子标记分析江华苦茶群体的遗传多样性和亲缘关系，结果表明，江华苦茶群体基因组DNA具有较高的多态性，与本研究结果相似。本研究结果也符合前人对大叶种茶和小叶种茶的研究结果[16-19]。通过聚类分析发现，50份苦茶供试材料可分为4个大类和多个亚群。亲缘关系树状图在分子水平上显示了西双版纳苦茶群体各单株间的亲缘关系，各2份供试茶树资源间均具有较大的遗传距离和较低的遗传相似度，遗传距离最小的为5号和12号（0.37），其相似度为0.690 8，整个遗传图谱表现出丰富的遗传多样性，可能与茶树资源来源于不同地区有极大的关系。这与刘本英等[20-21]研究云南大叶茶和野生茶的遗传多样性分析结果一致。

西双版纳具有丰富的苦茶资源，其遗传多样性丰富，但是现阶段对苦茶资源的研究甚少，苦茶资源的研究、开发及利用工作缓慢，对加快构建茶树资源核心种质库、分子指纹图谱等研究具有一定的影响，为此，加快西双版纳苦茶资源的分子技术研究，发掘一批功能性成分超常量的特异资源及特色茶树品种，筛选出有价值的特异资源和综合性状优良的苦茶种质资源，对保护和利用好云茶资源具有非常重要的意义。