miR-146a过表达羊驼黑色素细胞内转录组图谱分析

杜斌，刘学贤，郭湘，薛骥轩，范瑞文

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

哺乳动物毛发的颜色以及纤维直径和长度，是纤维生产动物经济价值最重要的影响因素。毛色基因也有助于对农场动物毛色的鉴定[1]。毛发的纤维直径、长度和颜色由遗传学和环境决定[2-4]。毛发和皮肤的颜色依赖于上皮基底部黑素细胞产生的黑色素[5]。哺乳动物黑素细胞能产生2种不同类型的黑色素，即真黑素（黑/棕色）和褐黑素（黄/红棕色），真黑素与褐黑色素的质量和比例决定了毛发和皮肤的最终颜色[6]。在啮齿类动物中，毛发和皮肤的颜色涉及到很多基因的共同作用。色素沉着是生物体一个非常复杂的生物学过程，目前人们仍旧还在探索miRNA对哺乳动物毛色调控的具体机制。有研究发现，miRNA可以调控黑色素合成过程中的主效基因并影响黑色素的生成。例如，酪氨酸酶相关蛋白1（Tyrosinase related protein 1，TYRP1）是直接影响黑色素合成的催化酶之一，也是miR-146a的靶基因之一，miR-146a通过抑制TYRP1的表达，从而直接影响酪氨酸向黑色素的转化，造成黑色素合成的产量显著减少[7]。小眼畸形转录因子（Microphthalmia-associated transcription factor，MITF）是黑色素合成关键酶酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）、酪氨酸酶相关 蛋白2（Tyrosinase related protein 2，TYRP2）和TYRP1的直接上游基因，在皮肤颜色和黑素瘤中起着重要作用[8]，MITF也是黑色素经典路径MAPK路径的下游重要调控因子。激活的MAPK可调控一些下游转录因子，如cAMP反应元件结合蛋白（cAMPresponsive-elementbindingprotein，CREB），当CREB接收到信号时会调节MITF的转录过程[9-10]，除了MAPK这个路径，还有其他影响色素生成的重要途径如c-kit信号和WNT/β-catenin通路。其中，WNT/βcatenin信号通路在胚胎发育中起重要的作用[11]。有研究表明，WNT/β-catenin信号通路也可影响黑色素瘤的生成[12]。WNT/β-catenin信号通路分泌WNT蛋白质并与其受体Frizzled（FZD）结合组成复合物并相互作用，从而触发一系列生化反应[13-15]。

为了更好地了解miR-146a在毛发和皮肤颜色中可能的作用，本研究使用高通量测序，挖掘了miR-146a对的羊驼黑色素细胞的调控，旨在揭示许多由miR-146a调控的mRNA转录物，并提供对其潜在功能的深入了解。这些数据将有助于更好地了解黑色素沉着这一复杂的分子机制是怎样形成的。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为4代羊驼黑色素细胞（山西农业大学羊驼生物工程实验室提供）。Trizol试剂（Invitrogen，USA）和黑色素培养基（sciencell，美国）。

1.2 方法

1.2.1 转录组测序培养羊驼7代黑色素细胞（山西农业大学羊驼生物工程实验室保存的羊驼黑色素细胞），确保细胞状态良好无污染。待细胞成功转染后，使用1×的PBS清洗2～3次后，加入Trizol裂解液并立即置于液氮中。使用Trizol试剂根据制造商的说明书提取样品中的总RNA。通过凝胶电泳评估RNA的完整性，并通过OD260/OD280与RIN值的比值检查RNA的纯度。选择RIN值大于7.5并且OD260/OD280值大于1.7的RNA样品进行深度测序。

1.2.2 cDNA测序文库的构建及Illumina-Solexa高通量测序从羊驼黑色素细胞总RNA中分离pohy（A）mRNA，将分离的mRNA片段化，随后使用随机的第1链cDNA合成聚体引物。使用缓冲液、dNTP、RNaseH和DNA聚合酶I合成第2链cDNA。使用QiaQuick PCR提取试剂盒纯化短cDNA片段。碎片末端被修复，A尾随后连接测序适配器。在琼脂糖凝胶电泳后选择合适的大小片段，并用作PCR扩增的模板。使用Illumina HiSeqTM2000进行文库的测序。

1.2.3 转录组数据分析在装配之前，通过移除适配器和低质量的读数来清洁原始读取。序列装配使用短读装配程序Trinity（http：//www.genomics.cn）进行。用一些数据库（NR、Swiss-Prot、KEGG和COG）进行了Blastx比对，如果不同数据库的结果彼此冲突，当确定序列方向时，遵循NR＞Swiss-Prot＞KEGG＞COG的优先顺序；如果序列与上述数据库不一致时，则使用ESTScan软件确定其序列方向。所有序列使用WEGO（http://wego.genomics.org.cn/cgibin/wego/index.pl）进行GO功能分类。

1.2.4 鉴别差异表达基因和途径分析基于前面描述的方法，严格算法用于鉴别试验组和对照组之间差异表达的基因。使用FDR（假发现率）值0.001和＞2的RPKM比值分析，将差异表达基因（DEG）映射到GO数据库的每个词条上（http://www.geneontology.org/），计算每个词条的基因数，并获得每个GO术语的基因和基因数列表，并在KEGG途径数据库（http：//www.genome.jp/kegg/path.html）的帮助下，进一步研究了DEG。

2 结果与分析

2.1 原始数据组装分析

过滤原始数据后，获得了miR-146a试验组21 216 335次清洁读数、53.15% GC百分比和NC对照组27 926 442次清洁读数、52.82% GC百分比；这些清洁读数组装共得到161 666条序列，组装完整性比较高。分别从试验组和对照组中产生16 672 337、22 047 775条序列，并且确定序列的平均长度为641.73 nt，其中1 kb以上的序列共有20 019条（图1）。

2.2 序列的功能分类

检测羊驼黑色素细胞中序列对蛋白质和核苷酸数据库的Blast分析（e值＜0.000 01）揭示了25 867个已知基因，其中4 848个通过COG分类分析注释。根据它们推定的功能，将这些基因分成25个类别，12 667个基因也通过GO分类分析加以注释（图2），根据其推定的功能（图3）分为3类（生物过程、细胞成分、分子功能），并列举出羊驼黑色素细胞中最富集的GO条目（图4）。

2.3 不同基因在miR-146a组和NC组中的差异表达及所涉及的KEGG路径

使用先前描述的算法[16-17]，鉴定了试验组和对照组之间差异基因的表达，共有292个已知基因差异表达，其中101个上调，191个下调。对于GO分析，将差异表达基因分别归入细胞组分、分子功能和生物过程类别。大部分的差异表达基因分为2个GO类别，包括MAPK家族和c-kit、WNT/β-catenin信号通路的基因和4个未知基因（表1）。

为了验证转录组测序结果，随机选择了5个基因进行实时PCR，以确定其在试验组和对照组中的相对表达。实时PCR结果显示，选择的5个基因表达量显著，与转录组测序数据一致（图5）。

表1 在miR-146a组和NC组中的差异表达基因及所涉及的KEGG路径

3 结论与讨论

哺乳动物的毛发颜色是由黑色素细胞产生的黑色素决定的，黑色素细胞中合成2种初级黑色素（真黑素和褐黑素），这些黑色素的质量以及产生的真黑色素和褐黑色素的比例，决定了头发和皮肤的最终颜色[18-19]。已有研究报道，传统的Sanger测序法可以从绵羊和羊驼皮中产生表达序列[20-21]。

为了进一步研究miR-146可能在羊驼黑色素细胞中发挥的重要作用，本研究利用Illumina技术从过表达miR-146的羊驼黑色素细胞中产生了数个转录组序列。从这些数据读取中发现，已知有161 666个序列在羊驼黑色素细胞中表达。这便为之后研究黑色素细胞的调控基因提供了基础。从表达基因的GO和KEGG通路分析发现，大多数与细胞功能相关。其中，与黑色素形成有关的MAPK信号通路，可以通过调控下游不同转录因子，从而调控黑色素的合成[22]。有报道发现，被激活的MAPK可以带着信号去选择性地激活下游基因[23-24]。黑素细胞发育过程中，影响黑素瘤形成的基因可能对黑色素细胞增殖和迁移有着重要的调控[25]。WNT/βcatenin通路常常被一些癌症因子激活，然而，其调控下游基因的方式是不同的[14]。这些差异可能是与黑色素细胞和上皮细胞的生物学以及β-catenin活化的多样性有关。黑色素瘤中WNT/β-catenin信号通路的激活可能与WNT信号级联成分或参与其调控的蛋白质的基因表达改变有关[26]。不依赖βcatenin的WNT信号传导途径是通过将WNT与FZD结合而启动的，然后激活各种下游效应子[14]。本研究对差异表达基因的GO通路分析也发现，许多基因要么是细胞的一部分，要么参与了细胞功能。本研究特别关注与色素沉着和黑色素生成相关的途径。黑色素生成是一个复杂的生化级联反应，尽管黑素细胞的数量通常保持不变，但较深的皮肤色素沉着很可能会影响毛色，这便与更多黑素体的存在有关[27]。影响黑色素生成的因素很多，还有待进一步探索。

本研究结果揭示了miR-146a在羊驼黑色素细胞中的生理功能，这将有助于了解miRNA在动物毛发和皮肤颜色发育中的影响。