盐酸川芎嗪通过mTOR信号通路和凋亡通路抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖研究

田小娟，张 静

（漯河医学高等专科学校，河南 漯河 462002）

根据相关医学研究显示，在前列腺疾病治疗方面具有重要作用的物质是PI3K/Akt/mTOR信号通路，其中的雷帕霉素靶蛋白能够在细胞存活和生长的过程中完成自身的控制和引导作用，有效调节不同细胞包括存活、增殖。

1 实验材料

材料准备需要前列腺癌PC-3细胞株，并且保证其中含有10%的FBS，放置于CO2的饱和湿度敷箱培养，培养温度为37℃；

前列腺上皮细胞RWPE-1细胞，RWPE-1细胞在含0.05 mg/ml BPE和5ng/ml EGF的K-SFM，培养温度为37℃；

人结直肠癌细胞HCT-116细胞株，培养环境为含有10%的FBS（Hyclone），100 U/ml 青霉素，100 U/ml链霉素的DMEM（High Glucose）中，培养温度为37℃；

2 实验方法

2.1 MTT检测细胞增殖

（1）96孔板接种细胞：PC-3和RWPE-1、HCT-116接种浓度为5000个/孔、2000个/孔。每9个实验组为96孔板，每一个孔板上有6个复孔。其中的培养要求是0.25%胰酶-EDTA能够在常规环境中完全消化，并且成为单个细胞悬液。培养的要求为CO2的饱和湿度敷箱培养，培养温度为37℃，培养时间为24小时。

（2）刺激细胞：次日盐酸川芎嗪干预细胞，刺激浓度依次为0、0.5、1.3、2.5、3.5、4.9、6.2、8.4 mM。培养的要求为CO2的饱和湿度敷箱培养，培养温度为37℃，培养时间为72小时。

（3）呈色：在上述步骤进行之后，在培养容器中添加5 mg/ml的MTT溶液20 ul（每孔剂量），并且保证培养环境的稳定和正常，此次的培养时间为3小时左右。在此基础上，将上清液吸走，并且在培养孔中添加150 ulDMSO。值得注意是添加此类试剂之后，液体中极易出现沉淀物，需要将试管轻轻晃动，保证添加剂能够充分溶解。

（4）比色：用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定各孔的吸收值，制成Excel表格，进行统计。

以上的实验环境需要重复三次，保证实验结果的准确和有效。

2.2 Western blotting检测凋亡相关蛋白，mTOR蛋白及其下游关键蛋白及其磷酸化蛋白的表达

（1）SDS-PAGE凝胶电泳

灌分离胶：TEMED加入的计量与分子量的不同配置不同浓度之间具有密切的关系。在灌胶的过程中应当保证灌胶的速度，在灌胶高度在容器5.5 cm左右即可停止。进而使用双蒸水缓慢封闭，在操作的过程中应当保证动作的轻柔，结束操作之后将其放置，并且自由凝固，时间为30 min。

灌浓缩胶：30 min自由凝固结束之后，观察容器中水和胶水之间中存在一条明显的折线就能够证明胶水已经凝固。这种情况下可以倾倒上层水，之后使用滤纸吸干水分。将配好的浓缩胶快速灌入，结束操作之后将其放置，并且自由凝固，时间为30 min。

上样，加入蛋白样本。

电泳，根据目的蛋白的分子量调节电压。当电泳至胶的下缘时停止电泳。

（1）蛋白转膜

切胶：电泳完毕后，将玻璃板放入水中小心撬开，把胶取出，参照marker按照目的蛋白的分子量大小切胶，切完之后测量长和宽，放入新配置的转膜缓冲液中室温摇晃。

剪膜和滤纸：换新的清洁干燥的一次性手套，依照胶的长和宽裁剪PVDF膜和滤纸。首先将剪好的PVDF膜放在甲醇中活化30 s，然后将活化的PVDF膜和滤纸放入转膜缓冲液中室温摇晃15 min。

（2）一抗孵育

磷酸化一抗稀释液：5%的牛血清白蛋白（TTBS稀释）；非磷酸化一抗稀释液：1%的牛奶（TPBS稀释）。将膜放入加了一抗的稀释液中，置于4℃冰箱缓慢摇床，放置12小时。

（3）二抗孵育

24小时之后，将膜取出用磷酸化或非磷酸化漂洗三次，每次十分钟。磷酸化二抗稀释液：3%的牛奶稀释；非磷酸化二抗稀释液：3%的牛奶稀释，将膜放入加了二抗的二抗稀释液中，室温慢摇3小时。孵育完毕后用磷酸化或非磷酸化漂洗三次，每次十分钟。

（4）化学发光，显影

按照试剂的相关说明将其中的发光试剂混合，并且尽量保证试剂能够溶解均匀。

2.3 m7GTP 琼脂糖珠 pulldown检测

2.3.1 细胞准备

对于PC-3细胞，0.25%胰酶-EDTA进行常规消化，PC-3和RWPE-1、HCT-116接种浓度为5000个/孔、2000个/孔。每9个实验组为96孔板，每一个孔板上有6个复孔。45万个细胞/瓶。并且将以上的细胞进行24h刺激，换取新鲜培养基并加入盐酸川芎嗪，使其终浓度分别达到4.9、6.2、8.4mM，持续培养时间为24小时。

2.3.2 蛋白样品的制备

（1）保证培养时间超过24 h，对细胞进行冲洗，冲洗使用的试剂是4℃预冷的PBS。每瓶细胞将PBS尽量吸弃干净，而后加入200 ul含蛋白酶抑制剂的RIPA，冰上裂解20 min。

（2）在上述工作完成之后，使用等移液枪缓慢将细胞碎片吹打至瓶底一角（称为裂解蛋白液），在裂解蛋白液的过程中应当保证不要气泡。将裂解之后的试剂放在冰上静置10 min左右，与此同时将离心机4℃预冷。

（3）将裂解蛋白液移至EP管内，放入预冷的离心机中，12000 r，30 min心，同时打开紫外分光光度仪进行初始化。

（4）上述实验步骤完成之后，将上清液转移到新的EP管内，注意标记。从三个EP管中各吸取2 ul的样本各加入到2 ml考马斯亮蓝G250中充分混匀，并且静置反应10 min。

（5）取3×10 ul共三管，用不含蛋白酶抑制剂的RIPA洗3次，在上述步骤进行之后，在培养容器中添加5 mg/ml的MTT溶液20 ul（每孔剂量），并且保证培养环境的稳定和正常，此次的培养时间为3小时左右。在此基础上，将上清液吸走，并且在培养孔中添加150 ul DMSO。需要将培养皿放在摇床上轻轻摇动，保证其中的试剂能够充分溶解。

2.3.3 蛋白样品的制备

（1）在以上工序完成4 h之后，把三个EP管均放置在4℃预冷的离心机中，清洗EP管，清洗剂使用含蛋白酶抑制剂的RIPA。清洗的时间阶段为3分钟一次。

（2在）三个EP管中分别加入2×SDS+β-硫基乙醇25 ul，在加入之前根据实验室内的温度进行适当预热，将以上的试剂于沸水中煮10 min，备用。

3 实验结果

3.1 细胞增殖的检测

MTT检测刺激浓度依次为0、0.5、1.3、2.5、3.5、4.9、6.2、8.4 mM的盐酸川芎嗪刺激前列腺癌PC-3细胞48 h和72 h，对人体结肠直肠癌细胞HCT-116和前列腺上皮细胞RWPE-1刺激在48 h小时之后细胞出现的变化情况，由此可见不同浓度的盐酸川芎嗪对于RWPE-1进行刺激的效果并没有明显的变化，即（P＞0.05）。其中细胞具有明显改善和变化的是7.2mM浓度以上的盐酸川芎嗪，与此同时1.2 mM的盐酸川芎嗪对于肿瘤细胞PC-3细胞和HCT-116的抑制作用也是十分明显的，这就能够判断出肿瘤细胞对于盐酸川芎嗪的刺激作用具有较为明显的依赖性。不同浓度的盐酸川芎嗪对于肿瘤细胞的影响存在一定的时间和浓度的关联性和依赖关系，在刺激时间在48h和72h状态下，IC50分别为7.2 mM和4.8 mM。

3.2 Western blotting检测mTOR蛋白和下游关键蛋白及其磷酸化蛋白的表达

根据Western blotting检测结果能够表现出，在相同的环境背景下，4.8 mM、7.2 mM的盐酸川芎嗪对于p-mTOR的表达都具有明显的影响作用，并且应用在p-p70S6k、p-S6、p-4E和p-4E-BP1的表达的影响上效果相同，其中（P＜0.01）。但是盐酸川芎嗪对于mTOR、p70S6、S6、4E的表达影响下并没有明显的关联性和统计学意义（P＞0.05），由此可见，盐酸川芎嗪可能通过抑制mTOR及其下游相关蛋白的磷酸化水平发挥作用。

4 结束语

盐酸川芎嗪在世界范围内的临床诊疗中具有广泛并且良好的使用效果，由于在治疗的过程中副作用较小，进而成为了医生们使用的高频药物。近年来，盐酸川芎嗪逐渐被发现在治疗前列腺肿瘤的治疗中具有良好的效果，但是其中存在的安全隐患和局限性仍旧未能得到良好的整合和研究。在诊疗过程中使用抗雄激素疗法能够取得相应的治疗成效，然而患者在接受诊疗的过程中经常出现对激素治疗的抵抗现象，进而影响了前列腺治疗的稳定性和有效性。长时间内对于治疗前列腺的方式方法均没有稳定的界定和实施，进而逐渐成为前列腺疾病治疗的关键性难题。盐酸川芎嗪通过mTOR信号通路和凋亡通路抑制前列腺癌PC-3细胞具有良好的诊疗效果，值得在临床中广泛使用。