丝胶蛋白对2型糖尿病大鼠肾脏氧化应激损伤和PI3K/Akt信号通路的影响

张雷 李东哲 陈志宏

(承德医学院，河北 承德 067000)

氧化应激在很多疾病的发生发展过程中起重要作用，包括肿瘤、高血压、糖尿病、动脉粥样硬化、慢性疲劳综合征、神经组织退化性疾病等〔1〕。并且，越来越多的证据表明，氧化应激在糖尿病肾脏损伤的发病中亦发挥着重要作用〔2,3〕。有研究报道，氧化应激的过程涉及多种信号转导通路，包括核因子E2相关因子2-Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1-抗氧化反应序列元件(Keap1-Nrf2-ARE)信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路、Toll样受体(TLRs)介导的信号通路等〔4〕。本课题组前期研究发现，丝胶(彩色蚕茧水提物)具有保护糖尿病时肾脏损伤的作用〔5〕，但具体的作用机制还需要进一步地深入探讨。本研究旨在探讨丝胶蛋白对2型糖尿病大鼠肾脏氧化应激损伤和PI3K/Akt信号转导通路的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 ①实验动物：购买自北京维通利华实验动物技术有限公司的SD大鼠48只，健康清洁级，大鼠合格证号：SCXK(京)2012-0001。②丝胶：1%的Na2CO3浸泡30 min(蚕茧:Na2CO3为1∶30)，95～100℃沸煮3 h提取2次，合并2次提取液并减压浓缩，浓缩液装入8 000～14 000 nm透析袋透析过夜，透析液冷冻干燥成粉末即为丝胶。③实验试剂：链脲佐菌素，美国Sigma公司；大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总一氧化氮合酶(tNOS)、过氧化氢(H2O2)检测试剂盒，南京建成生物科技有限公司；Trizol，北京茂建联科技有限公司；DNA marker，天根生化科技(北京)有限公司；PCR引物，宝生物工程(大连)有限公司。

1.22型糖尿病大鼠模型的建立及丝胶干预 采用随机的方法将48只大鼠均分为四组各12只，正常对照组(对照组)、2型糖尿病模型组(模型组)、丝胶低剂量组、丝胶高剂量组。采用高脂高糖饲料饲养+链脲佐菌素(35 mg/kg，2次)腹腔注射的方法建模，空腹血糖≥11.1 mmol/L为建模成功的标准。待建模成功后，丝胶低剂量组大鼠连续35 d按照1.8 g/(kg·d)的剂量灌胃丝胶；丝胶高剂量组大鼠连续35 d按照2.4 g/(kg·d)的剂量灌胃丝胶；模型组大鼠连续35 d以等量生理盐水灌胃。

1.3取材 各组大鼠用药结束后禁食12 h，使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，开胸于心脏取血后断头处死，取肾脏于冰盘上切成小块后入液氮中速冻，然后移入-80℃低温冰箱保存。

1.4检测大鼠血液指标 所取大鼠血液于4℃、3 000 r/min离心15 min，使用全自动生化分析仪分别检测血糖，血尿素氮和肌酐水平。

1.5检测大鼠肾脏氧化应激相关指标 取出低温保存的肾脏，按照试剂盒说明将肾脏组织匀浆、离心后取上清，检测肾脏组织中SOD、CAT、tNOS和H2O2的水平。

1.6检测大鼠肾脏PI3K和Akt mRNA的表达 提取肾脏组织的总RNA，测定RNA的浓度和纯度并进行鉴定，然后将RNA反转录为cDNA，保存于-20℃环境备用。以cDNA为模板，使用Real Time Q-PCR法扩增PI3K、Akt和GAPDH的片段，每个指标重复3次，以GAPDH为内参采用2-△△Ct法计算所得数据，作为目的mRNA的相对表达水平。

引物序列(5′-3′)：PI3K：正义链-CCAGAAGAAGGGACAGTGGTATG，反义链-TCGTAGCCAATCAGGGAGGT，产物大小183 bp；Akt：反义链-ATGGACTTCCGGTCAGGTTCA，反义链-GCCCTTGCCCAGTAGCTTCA，产物大小126 bp；GAPDH：正义链-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG，反义链-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA，产物大小143 bp。

1.7统计学分析 采用SPSS22.0软件进行方差分析，LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组血糖、血尿素氮、肌酐水平比较 模型组血糖、血尿素氮、肌酐水平较对照组明显提高(P<0.01)。丝胶低、高剂量组血糖、血尿素氮、肌酐水平明显低于模型组(P<0.01)；且丝胶高剂量组血尿素氮水平明显低于丝胶低剂量组(P<0.01)。见表1。

表1 各组血糖、血尿素氮、肌酐水平比较

与对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01；与丝胶低剂量组比较：3)P<0.01

2.2各组肾脏SOD、CAT、tNOS、H2O2水平比较 模型组肾脏SOD、CAT水平较对照组明显降低，tNOS、H2O2水平较对照组明显升高(P<0.01)。丝胶低、高剂量组肾脏SOD、CAT水平明显高于模型组，tNOS、H2O2水平明显低于模型组(P<0.01)；并且，丝胶高剂量组肾脏CAT水平明显高于低剂量组，H2O2水平明显低于低剂量组(P<0.01)。见表2。

2.3各组肾脏PI3K和Akt mRNA表达比较 模型组肾脏PI3K、Akt mRNA表达较对照组明显降低(P<0.01)。丝胶低、高剂量组肾脏PI3K、Akt mRNA表达明显高于模型组(P<0.01，P<0.05)；且丝胶高剂量组肾脏PI3K mRNA表达明显高于低剂量组(P<0.01)。见表2。

表2 各组肾脏SOD、CAT、tNOS、H2O2及PI3K、Akt mRNA水平比较

与对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01，3)P<0.05；与丝胶低剂量组比较：4)P<0.01

3 讨 论

目前，糖尿病肾脏损伤的致病机制并不十分清楚，研究者们认为系多因素参与、在一定的遗传背景和危险因素的共同作用下致病，包括肾脏血流动力学异常、高血糖造成的代谢异常、高血压、血管活性物质代谢异常、炎症、氧化应激损伤等〔2，3，6，7〕。氧化应激时活性氧(ROS)和活性氮(RNS)产生过多，体内氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。ROS包括超氧阴离子(·O2-)、羟自由基(·OH)和H2O2等；RNS包括一氧化氮(NO)、二氧化氮(NO2)和过氧化亚硝酸盐(ONOO-)等。由于NO的半衰期极短，一氧化氮合酶(NOS)是NO生成的主要限速酶，而NOS的性质相对稳定，因此目前常通过检测NOS代表NO的水平〔8〕。同时，机体存在两类抗氧化系统，酶抗氧化系统和非酶抗氧化系统，其中的酶抗氧化系统主要包括SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶等。ROS除了可直接损害组织细胞，还能激活多种氧化应激通路和抗氧化应激通路，从而间接加重或减轻组织细胞的损伤，其中即包括PI3K/Akt信号转导通路。

本研究结果说明在成功建立糖尿病大鼠模型的同时，模型大鼠亦出现了肾脏损害；氧化系统和抗氧化系统失衡导致的氧化应激和PI3K/Akt信号转导通路异常参与了糖尿病时肾脏损伤的病理过程。众所周知，高血糖会增加ROS的产生，导致氧化应激〔9，10〕。而增加的ROS可通过使肾足细胞凋亡增加破坏肾滤过膜的完整性或通过激活多种炎症相关通路导致细胞外基质过度积聚，从而造成肾脏损害〔11〕。PI3K/Akt信号通路存在于高等真核生物所有细胞中并高度保守，该途径涉及的关键因子包括PI3K和Akt，PI3K被磷酸化后激活Akt，从而介导细胞存活、生长、增殖、迁移和血管生成等多种生物学作用。近年研究发现，PI3K/Akt信号通路与氧化应激密切相关，PI3K/Akt信号通路被激活可减少氧化应激导致的细胞凋亡，并对H2O2诱导的肾近端小管细胞凋亡具有保护作用〔12，13〕。

本研究考虑丝胶可能通过以下机制发挥保护糖尿病时肾脏损伤的作用：①丝胶可减少氧化产物的产生及提高抗氧化酶的活性，恢复氧化作用与抗氧化作用之间的平衡，从而减轻氧化应激造成的损伤；②丝胶可能通过激活PI3K/Akt信号转导通路，进而减少氧化应激导致的细胞凋亡等，保护肾功能。并且，丝胶对糖尿病时肾脏损害的保护作用具有一定的剂量依赖性，但丝胶发挥保护作用的最佳剂量尚待深入研究确定。

丝胶是从彩色蚕茧中提取的水溶性蛋白，最早《本草纲目》记载蚕茧煮水可治“消渴”，我国民间当代亦有蚕茧泡水辅助降糖的验方。本研究亦证实，丝胶具有保护糖尿病时肾脏损伤的作用。