103 份小麦品种（系）抗条锈性和遗传多样性评价及基因检测

徐默然，蔺瑞明，王凤涛，冯晶，徐世昌

（中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

0 引言

【研究意义】小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformisf. sp.tritici）引起的一种世界性的真菌病害，破坏力度大，危害我国广大麦区[1]。小麦条锈菌喜好冷凉潮湿的环境，主要通过高空气流远距离传播，伴随降雨或者结露侵染小麦致使小麦发病。近年来，由于小麦条锈菌的不断变异导致新小种的出现及蔓延，使我国大部分主栽小麦品种出现抗病性“丧失”的现象[2]，从而造成小麦减产10%—70%，严重时甚至绝收[3]。选育并合理利用优良抗病品种是防治小麦条锈病最有效、安全、经济的方法[4]。【前人研究进展】由于当前流行生理小种CYR32、CYR33、CYR34 等的发展和积累，对我国主产麦区小麦安全生产构成重大威胁，并给小麦生产造成重大损失[5-7]，而且近十几年来，由于在小麦育种中大量使用相同和相近的亲本，导致新育成品种遗传基础日益狭窄、遗传变异率低[8-9]。目前，对当前条锈菌流行生理小种仍保持一定抗病性的主效基因有Yr5、Yr11—Yr16、Yr18、Yr36、Yr39、Yr44、Yr46、Yr48、Yr50、Yr52、Yr69及YrZH84等[10]。分子标记检测是目前分析Yr存在的比较有效的辅助方法，抗条锈病基因Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18、Yr26的分子标记已经广泛应用于全世界范围的小麦育种中，通过已知抗病基因的分子标记对品种进行基因检测，有助于明确抗性小麦品种携带的已知Yr。我国科研工作者[11-16]对国内各地区的小麦主栽品种进行抗条锈病评价以及抗病基因检测发现四川、甘肃、陕西、黄淮麦区等地小麦品种整体抗条锈病水平较低，与品种审定时相比抗性呈下降趋势，尤其是广泛而单一地利用抗条锈病基因，导致国内抗病品种（基因）布局不合理。同时，小麦品种遗传基础逐渐变得狭窄，将不利于减缓条锈菌生理小种的变异、减轻条锈病的发生。通过广泛分布于小麦基因组且具有较大遗传差异的SSR标记进行品种间遗传多样性分析，评估不同品种之间的亲缘关系以及计算品种之间的遗传距离，与抗病基因连锁分子标记检测相结合的方式进行抗性基因的分析，可大大提高研究的可靠性和准确性，发掘优质小麦材料。【本研究切入点】为了了解小麦品种（系）的抗条锈病整体水平，笔者实验室陆续对收集的小麦品种（系）进行抗条锈性鉴定[17-18]，本研究以中国当前主要流行小种CYR32、CYR33 和CYR34 对103 份小麦品种（系）进行苗期、成株期抗病性鉴定，并采用分子标记技术和聚类分析对供试品种（系）进行遗传多样性分析，选用已知重要抗条锈病基因Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18和Yr26的分子标记进行基因检测。【拟解决的关键问题】了解小麦品种（系）对我国当前流行小种的抗病水平和抗性类型及所含的重要抗条锈病基因状况，筛选可利用的新抗源，以期为小麦抗病种质资源的选择利用及品种/基因布局与轮换提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的103 份小麦品种（系），感病对照品种铭贤169（Mingxian 169）及Avocet S（AVS），已知基因载体品系Avocet S*6/Yr5、Avocet S*6/Yr9、Avocet S*6/Yr10、Avocet S*6/Yr18、Avocet S*6/Yr26以及我国当前小麦条锈菌流行生理小种CYR32、CYR33 和CYR34 均由中国农业科学院植物保护研究所麦类真菌病害研究组提供。

1.2 方法

1.2.1 小麦品种（系）抗条锈病鉴定 在中国农业科学院植物保护研究所人工气候室内进行小麦苗期抗性鉴定。每个供试品种（系）挑选出饱满籽粒30 粒左右，分3 份分别播种于9 cm×9 cm 营养钵中，置于人工气候室内培养，温室温度为15—18℃（昼）/10—14℃（夜），光照时间为12—14 h·d-1、光照强度为5 000—6 000 lx。待供试品种（系）幼苗第1 片叶完全展开，第2 片叶刚刚露出时，通过喷雾法将制备好的生理小种CYR32、CYR33 和CYR34 孢子悬浮液分别接种到供试小麦品种（系）上，以感病品种铭贤169 为对照，把小麦苗置于保湿桶内于9—10℃黑暗条件下处理18—24 h，然后转入自控温室内潜育发病；2018—2019年在中国农业科学院植物保护研究所野外科学观测试验站（河北廊坊）科研基地进行生理小种CYR32 成株期鉴定。每个品种（系）种植一行，行长3 m，行距0.33 m，每一畦种植60 个材料，两侧种植铭贤169作为诱发行，于2019 年4 月中旬小麦返青拔节期将小麦条锈菌新鲜夏孢子悬浮液均匀喷洒在诱发行叶片上，覆盖塑料布保湿过夜，第2 天清晨揭开塑料布；待对照铭贤169 充分发病后，按照0—9 级标准[19]调查反应型，将0—3 级划为免疫或高抗，4—6 级划为中抗，7—9 级划为感病，以 0、1%、5%、10%、20%、40%、60%、80%和100% 9 级标准记载严重度[20]。

1.2.2 SSR 检测 待幼苗长至2—3 叶取样并采用CTAB 法[21]提取并纯化103 份小麦基因组DNA，将浓度稀释至50 ng·µL-1备用。随机选取21 条染色体上的引物，由擎科生物技术有限公司合成，筛选出36 条具有多态性的SSR 引物，进一步分析103 份品种（系）的遗传多样性。

1.2.3 抗病基因的分子检测 查阅相关文献，筛选检测重要抗条锈病基因Yr5[22]、Yr9[23-24]、Yr10[25]、Yr15[26]、Yr18[27-28]、Yr26[29]的特异性引物（表1），由擎科生物技术有限公司合成。对供试品种（系）进行PCR 扩增，产物进行1.5%琼脂糖或6%聚丙烯酰氨凝胶电泳检测，观察条带特征并统计供试品种（系）抗病基因的特征带出现情况。

2 结果

2.1 供试小麦品种（系）抗条锈性鉴定与评价

利用生理小种CYR32、CYR33 和CYR34 对103份供试小麦品种（系）进行苗期抗条锈病分小种鉴定、成株期接种CYR32 进行抗性鉴定（表2）。结果表明供试品种（系）在苗期对3 个生理小种的抗病性存在明显的差异，其中，20 份品种（系）抗生理小种CYR32；34 份品种（系）抗生理小种CYR33；36 份品种（系）抗生理小种CYR34，但仅有6 份材料对3 个生理小种均表现为抗病，占5.83%。成株期CYR32 小种抗性鉴定发现55 份品种（系）表现为成株期抗性。由此可见，这些小麦品种（系）对当前流行条锈菌生理小种苗期抗性水平较低，而且同一小麦品种（系）对不同的生理小种抗性也存在明显差异。

2.2 供试小麦品种（系）遗传多样性分析

2.2.1 供试小麦品种（系）间遗传多态性分析 随机筛选了小麦21 条染色体上的172 对SSR 引物，36 对SSR 引物在103 份品种（系）间具有稳定清晰的多态性，共检测到130 个等位基因变异，平均每对引物检测到的等位基因数为3.6 个，变异范围为1—13 个，其中Xbarc59 检测到的等位基因变异数最多，为13个（图1）。利用软件NTSYS-PC 2.10 计算品种（系）间的遗传相似系数，得到其变异范围为0.50—0.93，平均值为0.66。其中北京11 和云麦27 之间的遗传相似性系数最高，为0.93，而农家品种大头红麦和国外品种Catoctin 之间的遗传相似性系数最低，为0.50，说明其遗传距离远，遗传差异大。

2.2.2 供试小麦品种（系）基于SSR 标记的聚类分析基于SSR 分子标记结果，对供试的103 份小麦品种（系）进行聚类分析（图2）。结果显示，103 个品种（系）聚为3 类，第Ⅰ类包含4 个材料，分别为花培112-2、尤皮2 号、鲁沾1 号以及Elkhart；第Ⅱ类包含 43 个材料，属于河南省的豫30691-1-4、豫30691-1-3、豫822367 和豫85-2325 聚在一起；属于陕西省同时来源于同一系谱咸农68/偃大72-629 的商洛76（57）22-8-7-1-2、商洛76（57）22-0-8-7-10、商洛76（57）22-0-8-17 和商洛76（57）22-8-7-1-8 聚在一起；来自国外的3 个品种Catoctin、Mason 和Norm 聚在一起，表明同一地区选育品种过程中使用了相同或亲缘关系相近的材料，导致育成品种之间遗传关系相近，聚为一类。第Ⅲ大类中具有相同亲本北京8 号的品种北京16、京作210、京作278、京作208、北京14、有芒红8 号、科冬81、北京11、北京12 和有芒白15 等聚在一起；以有芒红7 号/洛夫林10 号为系谱的丰抗7、丰抗9、丰抗10 和丰抗11 聚在一起；以华北187 为亲本的旱选10 号及华北187 选系的北京5 号、北京7号等和华北187 聚在一起；具有相同系谱的材料都聚在一个亚类，说明生产品种选育过程中多数选择了相近的亲本；在这一亚类中还包含供试材料中的农家品种白芒麦、三月黄小麦、大头红麦、小红芒麦、山西平遥小白麦、古城营等，农家品种分别来自山西、陕西、河北等，说明农家品种的亲缘关系与来源地无关。整体而言，来源于同一系谱或者具有相同亲本的品种，它们之间的亲缘关系较近，导致遗传关系相近，多样性狭窄。

表1 用于检测小麦抗条锈病基因的分子标记 Table 1 Molecular markers for the detection of the known resistance genes to stripe rust

2.3 抗条锈病基因的分子检测

利用当前小麦抗锈病基因Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18和Yr26已开发的特异性分子标记，对供试的103份品种（系）进行抗条锈病基因的检测，可以对其所携带的Yr进行初步筛查，以便确定抗源的开发价值和下一步研究的方向，结果汇于表2。利用FRANCIS等[23]开发的1B/1R 易位系SCAR 显性标记AF1/4 以及LIU 等[24]开发的一个1 598 bp 的易位系标记H20 作为Yr9的基因标记（图3），结果显示有15 份品种（系）含有两对标记的阳性条带；利用SINGH 等[25]开发的SCAR 标记Yr10F/R 及Yr10F1/R1 来检测Yr10（图4），阳性条带分别为543 和755 bp，有8 份品种（系）含有阳性条带；利用与Yr18共分离的基因特异性标记Cssfr5 以及阳性条带为150 bp 的特异性引物csLv34检测Yr18的存在（图5），共发现有19 份品种（系）含有与Yr18相同的阳性条带；利用WANG 等[29]根据EST-SSR 开发的大小为451 bp 的STS 标记WE173检测Yr26（图6），只有老兰麦含有Yr26阳性条带；利用MARCHAL 等[22]设计的特异性引物Yr5_insertion检测Yr5以及利用KLYMIUK 等[26]开发的特异性引物Yr15K1 来检测Yr15，未检测到供试品种（系）含有这两个基因的特征性条带。

表2 103 份小麦品种（系）苗期及成株期抗条锈病评价及6 个抗条锈病基因的分子检测Table 2 The resistance evaluation of 103 wheat cultivars (lines) to stripe rust at seedling and adult stages and molecular detection of 6 resistance genes

续表2 Continued table 2

续表2 Continued table 2

图1 引物Xbarc59 对1—21 份小麦品种（系）的扩增结果Fig. 1 Amplification result of 1 to 21 wheat cultivars (lines) by primer Xbarc59

图2 103 份小麦品种（系）遗传多样性检测的SSR 标记聚类图Fig. 2 Dendrogram of cluster analysis of 103 wheat cultivars (lines) based on SSR markers for the genetic diversity

图3 引物H20 检测Yr9 电泳图Fig. 3 Electropherogram of Yr9 with primer H20

3 讨论

3.1 小麦条锈病抗性评价

由于小麦条锈菌毒性变异频繁，品种抗病性丧失较快。因此，对主要麦区的重要推广品种和抗源材料及时进行抗条锈性测定，对品种合理布局和抗源利用显得尤为重要。本研究利用当前流行的条锈菌生理小 测到含有本研究中涉及的已知基因Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18和Yr26，推测6 份品种可能含有其他已知基因或者未知抗病基因。郑6 辐和宁麦3 号是诱变选育出的高产品种。京411 是20 世纪90 年代育成的品种，一直是北部冬麦区广泛使用的骨干亲本。京作278其系谱为北京8 号//农大183/早洋麦，扬麦158 亲本中含有意大利引进的St 1472/506，而老兰麦是我国的农家品种，这些品种经过历代的选择仍保持着良好的种CYR32、CYR33以及CYR34对103份小麦品种（系）进行抗性鉴定，其中苗期对参试小种表现为抗病的品种（系）分别有20、34 和36 份；对于生理小种CYR32表现为全生育期抗性的20 份品种（系），在田间成株期只有15 份仍表现抗性，表明有5 份品种（系）在田间试验中不再对CYR32 表现为抗性，可能是低水平高温成株抗性在田间相对较低的温度下未能完全表达[30]。在103 份品种（系）中，仅有郑6 辐、宁麦3 号、老兰麦、京411、京作278、扬麦158 共6份品种对3 个生理小种均表现为抗病，且未在其中检 抗性，应加以充分利用。在小麦条锈病防控中，抗病品种轮换种植可以形成群体抗性多样化来控制锈菌群体组成的变化和优势小种形成，防止品种抗性丧失。

供试品种（系）在苗期仍然有近94.17%（包括成株期抗病和感病品种）的品系对至少一个当前流行小种感病。ZENG 等[30]苗期接种CYR23、CYR29、CYR32、CYR33 和CH42 鉴定，发现494 个小麦品种中的大多数（71%）表现为感病，只有23 个品种（4.7%）对温室中测试的所有5 个主要生理小种具有抗性。这一现状令人堪忧，值得重视。因此，从对小麦条锈菌的治理和防控策略出发，当前应该积极在所有这些区域中使用有效全生育期抗性基因与持久的成株期抗性基因组合。使用具有多个或不同抗性基因的抗性栽培种能够减少病原菌的积累，如果品种易受影响，应尽快退出生产。

图4 引物Yr10F/Yr10R 检测Yr10 电泳图Fig. 4 Electropherogram of Yr10 with primer Yr10F/Yr10R

图5 引物csLV34 检测Yr18 电泳图Fig. 5 Electropherogram of Yr18 with primer csLV34

图6 引物WE173 检测Yr26 电泳图Fig. 6 Electropherogram of Yr26 with primer WE173

3.2 遗传多样性分析

SSR 标记是一种较为成熟的分子标记技术，分布于小麦的整个基因组中，广泛用于小麦种质资源间遗传多样性、基因检测、种属间的亲缘关系鉴定等方面的研究。高睦枪等[31]利用53 对SSR 引物对48 个品种（系）进行遗传多样性分析，共检测到367 个等位变异，遗传相似性系数变异范围为0.75—0.98，认为5个SSR 即可将不同品种很好地分类；付宝建[32]对95个品种进行遗传多样性分析，筛选出28 条具有多态性的引物，共扩增出227 条谱带，品种间遗传相似系数变异范围为0.54—0.96，揭示出供试小麦品种遗传变异较小，遗传基础比较狭窄。

本研究中利用36 对引物对103 份品种（系）进行遗传多样性分析，共检测到130 个等位基因变异，平均每个位点检测到的等位基因数为3.6 个，变异范围为1—13 个。利用软件NTSYS-PC 2.10 计算品种间的遗传相似系数，得到其变异范围为0.50—0.93，平均为0.66。这与傅晓艺等[33]利用21 个SSR 引物对分析了75 份小麦品种的遗传多样性，其遗传相似系数平均为0.66 以及赵军海等[34]利用74 个SSR 引物对103 份中国主要优质小麦进行了遗传多样性分析，其品种间遗传相似系数平均值为0.64 结果一致。MEGA7 聚类结果中，来自于同一地区的品种大多都聚到一类，系谱来源相同的也聚在一类，说明小麦品种（系）之间的亲缘关系与品种来源有很大的关系。根据苗期、成株期抗性鉴定和聚类分析结果，可以从中选择具有不同遗传背景的抗性材料进行组合配置，提高品种的遗传多样性以及抗病性，控制并防止病害的流行。

3.3 已知抗病基因检测

利用已开发的抗病基因特异性分子标记进行抗病基因检测，有助于初步筛查供试材料是否携带某一已知Yr。就目前小麦抗病基因分子检测体系中，由于连锁标记与目标基因还存在一定的距离，因此无论哪类标记，单独使用都不足以判断其是否携带某已知Yr，必须结合抗病谱鉴定以及系谱分析予以辅证。目前，在国际上已经正式命名的80 多个小麦抗条锈病基因中，Yr5、Yr15等仍然对目前流行的生理小种保持良好的抗性。本研究中通过对已知基因两侧紧密连锁的分子标记进行分子检测，未检测到含有Yr5和Yr15阳性条带的品种（系）。

含有黑麦1B/1R 易位片段的品种（系）作为抗源曾在小麦抗病育种工作中起着积极的作用，在易位片段上有4 个抗病基因：Yr9、Lr26、Sr31和Pm8，兼抗条锈、叶锈、秆锈和白粉病，作为主要抗源在全世界广泛应用。但是自从1983 年CYR29 产生以后，1B/1R 给小麦带来的抗性也在逐渐丧失，导致20 世纪90 年代以来条锈病和白粉病在有些地区大面积流行[35]。黄亮等[13]检测到97 份材料中1B/1R 易位系占44.3%，这些品种中根据其系谱可知其1B/1R 易位系可能来源于洛夫林10、洛夫林13、阿芙乐尔等。本研究中检测到有15 份品种（系）含有Yr9阳性条带，其中丰抗7、丰抗9 以及丰抗10 均来源于同一系谱有芒红7 号/洛夫林10 号，因此其1B/1R 易位系可能来自于洛夫林10。根据苗期抗性鉴定结果可知，这些品种对当前流行小种都表现为感病，因此我国以后应减少Yr9在小麦育种中的使用。

Yr10最初在小麦品系PI 178383 中发现，位于1B染色体的短臂上。基于Yr10序列设计的两对引物（Yr10F/R 和Yr10F1/R1）[25]对供试品种（系）进行检测，有8 份品种（系）检测出Yr10阳性条带，但这8份品种（系）苗期对CYR32 和CYR33 表现为感病，不符合Yr10的抗性谱，所以不具有Yr10，原因可能是由于在非分离群体中利用分子标记进行筛选时，在不具有抗性基因的材料中检测到标记基因的概率会更大[36]。同时庄巧生[37]认为，在中国小麦育种史上，没有使用Yr10和Yr15的证据。

Yr18是成株期抗病基因，与抗叶锈基因Lr34和抗白粉基因Pm38紧密连锁，慢条锈病性稳定，具有一定的利用价值。成株期抗性鉴定表明有55 份品种（系）为成株期抗性，本研究检测到含有Yr18阳性条带的品种（系）有19 份，这些品种（系）中未检测到其含有全生育期抗性基因，因此这些品种（系）成株期抗性应为Yr18控制，剩余36 份品种（系）中应该含有其他成株期抗性基因。在国内的部分研究中，韩德俊等[38]筛选50 份抗原中21 份可能携带Yr18；杨文雄等[39]使用STS 标记csLV34 在231 个中国育成品种和422 个农家品种中鉴定了Lr34/Yr18，其发现频率分别为育成品种和地方品种的6.1%和89.6%，表明基因高频率存在是由于在中国的育种计划中倾向于使用更容易选择和培育成现有作物品种的显性R 基因造成的。

由Triticum aestivum-Haynaldia villosa易位系携带的Yr26位于1B 染色体上，目前Yr26对CYR32 和CYR33 表现为抗病，但是对近年出现的新生理小种CYR34 表现为感病，这表明Yr26不能单独使用。通过抗病基因检测发现只有老兰麦含有Yr26阳性条带，其对本试验所测试的生理小种均表现为全生育期抗性。因此，老兰麦的抗性是由一个新的全生育期抗性基因所提供。刘太国等[40]研究表明，自2009 年以来在西南地区出现了对Yr26具有毒性的菌株V26，其对Yr10和Yr26具有联合毒性，导致中国生产上应用较多的携带Yr26的92R 系和贵农抗源面临抗性丧失的威胁。

通过抗病基因检测分析了103 个小麦品种（系）中6 个抗性基因的分布，结果与ZENG 等[30]的研究结果一致，Yr9和Yr18是鉴定最多的基因，而Yr5和Yr15在少数品种中鉴定出来。目前我国小麦种植存在两个突出的问题，一个问题是一些Yr的过度使用，例如Yr9、Yr10以及Yr24/Yr26，这将导致育种群体中抗性基因的多样性降低，并且不利于培育持久抗病品种；另一个问题是持久抗病基因尚未和一些全生育期抗病基因结合使用，持久抗病基因Yr18在供试品种（系）中占有18.45%，但多数都是单独存在，存在多基因聚合的品种较少。因此，通过抗病基因检测，可以避免一些Yr的过度使用，并且可以有目的地引入持久抗病基因。

4 结论

103 份小麦品种（系）对不同生理小种抗性差异大，苗期的抗性水平较低，仅有6 个品种郑6 辐、宁麦3 号、老兰麦、京411、京作278 和扬麦158 对所有测试生理小种表现为全生育期抗性，其中可能具有新的抗条锈病基因；103 份品种（系）成株期抗性较好，对CYR32 有55 份品种（系）表现为成株期抗性，基因检测成株抗性基因Yr18使用频率较高。在今后小麦育种工作中应充分利用优质已知抗性资源，发掘新抗性材料，选择具有不同遗传背景的抗性材料进行组合配置，提高品种的遗传多样性以及抗病性，培育多基因聚合的持久抗性品种。