胶原三股螺旋重复蛋白1基因真核表达载体的构建及其与microRNA-30b关系初探

周辉芳， 隗和儒， 马士朝， 张超群， 王君平， 杨新英， 谢 英， 孙殿兴

1 河北医科大学研究生学院， 石家庄 050017； 2 中国人民解放军联勤保障部队第九八〇医院全军肝病中心， 石家庄 050082； 3 承德医学院， 河北 承德067000；4 河北医科大学实验动物学部 河北省实验动物重点实验室，石家庄 050017

胶原三股螺旋重复蛋白1(collagen triple helix repeat containing 1，CTHRC1)是一种组织修复过程中分泌的外分泌蛋白，参与受损后的血管重塑修复过程。近年来的研究发现CTHRC1可以参与到多种实体肿瘤细胞的发生与进展过程，如肝癌[1]、卵巢癌[2]、宫颈鳞状细胞癌[3]、骨肉瘤[4]等，并与肿瘤的增殖、侵袭及转移密切相关。microRNA(miRNA，简写为miR)是一类由18～25个核苷酸组成的非编码RNA。这些核苷酸通过与目标信使RNA(mRNA)的3′端非编码区域结合来实现对目标基因的调节。在人类肿瘤中，miR-30b已被证实是一种在癌症发病机制中起着重要作用的肿瘤抑制基因，但在少数情况下发挥类似致癌基因的作用[5-6]。为进一步研究CTHRC1与miR-30b在人肝癌细胞的侵袭与转移方面的作用，本研究首先构建pCTHRC1-IRES2-EGFP真核表达载体，在此基础上，验证了CTHRC1与miR-30b的关系，为下一步研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试剂 DMEM培养基及胎牛血清(FBS)购自美国Gibico公司；Q5@ PCR Master Mix (2X)购自英国NEB公司；Gene Ruler 1 kb DNA Ladder购自美国Thermo Scientific公司；T4连接酶、NheⅠ/XhoⅠ限制性内切酶、DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker、感受态细胞E.coli Competent Cells购自大连TaKaRa公司；Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司；真核表达载体pIRES2-EGFP为本实验室保存；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒QIAprep Spin Miniprep Kit、miRNeasy Mini Kit和miScript PCR Starter Kit购自德国QIAGEN公司；引物由上海生工公司合成；has-miR-30b-5p mimic与Negative control由广东锐博生物科技有限公司提供；兔抗人CTHRC1多克隆抗体购自美国Proteintech公司。

1.2 细胞和细胞培养 293T细胞、人肝癌细胞Huh7和HepG2均为本实验室保存。在含10%FBS的DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO2的湿润条件下培养，细胞每隔2 d传代1次。

1.3 CTHRC1目的基因克隆 在NCBI数据库中查找CTHRC1 CDS+3′UTR区序列(登录号: NM_001256099.2)，委托上海生工公司合成克隆至pUC57载体。设计引物，上游引物F：5′-GACACGCTAGCATGTGGCCGCCAGGT-3′(含NheⅠ酶切位点)，下游引物R：5′-GTGTCCTCGAGTTATTTAAAGATATTA-3′(含XhoⅠ酶切位点)，产物长度为1095 bp。以含有CTHRC1 CDS+3′UTR区的合成序列为模板，用F/R特异性引物PCR扩增，NheⅠ/Xho Ⅰ 双酶切，回收纯化，克隆至pIRES2-EGFP载体。

1.4 载体构建 NheⅠ/XhoⅠ双酶切载体pIRES2-EGFP和1095 bp的CTHRC1 PCR产物(见1.3)，行1%琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，切胶回收载体及DNA片段。按照TakaRa DNA Ligation Kit Ver.2 .0试剂盒说明书配制连接体系, 将CTHRC1 DNA片段与pIRES2-EGFP真核表达载体进行连接。连接产物转化至DH5α E.coli Competent Cell，37 ℃培养12 h后挑取阳性克隆。质粒进行小量制备，双酶切鉴定并送上海生工公司测序。

1.5 质粒转染 分别将293T、Huh7和HepG2细胞接种于6孔板，每孔接种1×105细胞，待细胞汇合度约80%时，用PBS洗涤2次，然后换上无血清无抗生素的DMEM培养基500 μl。将脂质体Lipofectamine 3000与质粒分别与250 μl无血清无抗生素的DMEM培养基混合，5 min后再将两者混合，室温孵育15 min后均匀加入待转染细胞，培养48 h后换成DMEM完全培养基，计算转染效率。取5个不同视野分别计数表达绿色荧光蛋白的细胞数和总细胞数，按下列公式计算转染效率：转染效率=(荧光显微镜下细胞数/总细胞数)×100%。

1.6 Western Blot检测CTHRC1蛋白表达 miR-30b mimic、control、pCTHRC1-IRES2-EGFP质粒和pIRES2-EGFP质粒，于转染48 h后，收取转染效率达85%以上的细胞制备蛋白，常规进行Western Blot实验，检测CTHRC1蛋白表达水平的变化。

1.7 RNA提取和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-30b表达 293T细胞中转染miR-30b mimic、control、pCTHRC1- IRES2- EGFP质粒和pIRES2-EGFP质粒，培养48 h后收取转染效率达85%以上的细胞，使用miRNeasy Mini Kit(QIAGEN)从细胞中提取RNA，使用miScript PCR Starter Kit(QIAGEN)逆转录及定量检测miR-30b表达水平，具体方法参照试剂说明书。has-miR-30b-5p引物由美国GeneCopoeia公司提供(Cat# HmiRQP0393)；内参U6引物由德国QIAGEN公司提供(Lot No.160026679)。以U6为内参，2-ΔΔCt计算miR-30b相对表达量。

1.8 统计学方法 使用SPSS21.0统计软件进行数据分析。计量资料两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTHRC1 PCR扩增产物及pIRES2-EGFP双酶切产物 以CTHRC1 CDS+3′UTR合成序列为模板，用含有酶切位点的特异性引物进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，结果示回收片段约1100 bp；用NheⅠ、XhoⅠ双酶切pIRES2-EGFP后，1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，回收约5300 bp的片段(图1)。

注：a，1为DL2000 DNA标准参照物，2为NheⅠ、XhoⅠ双酶切CTHRC1 PCR产物；b，1为1 kb DNA标准参照物，2为载体pIRES2-EGFP，3为NheⅠ、XhoⅠ双酶切pIRES2-EGFP。

图1CTHRC1PCR扩增产物及质粒pIRES2-EGFP的双酶切产物

2.2 重组质粒载体构建及鉴定结果 重组质粒两个条带的大小分别为5300 bp和1100 bp，与预期结果一致, 均应为阳性克隆(图2)。基因序列测定结果显示序列与GeneBank公布序列完全一致。载体构建完全正确，符合下一步实验设计要求。

注：1，DL15000 DNA标准参照物；2，载体pIRES2-EGFP；3，NheⅠ、Xho Ⅰ 双酶切pIRES2-EGFP；4，重组质粒pCTHRC1-IRES2-EGFP；5，Nhe Ⅰ、Xho Ⅰ 双酶切pCTHRC1-IRES2-EGFP；6，DL2000 DNA标准参照物。

图2重组质粒的双酶切鉴定

2.3 转染效果评价 将2 μg和4 μg的pCTHRC1-IRES2-EGFP质粒分别与6 μl和12 μl的Lipofectamine 3000混合转染Huh7及HepG2细胞，48 h后于荧光显微镜下观察，转染效率分别为90%、89%和85%、83%。结果表明，2 μg质粒和6 μl Lipofectamine 3000混合可达到最大的转染效率(图3)。

2.4 CTHRC1基因表达与miR-30b表达水平分析 与对照组比较，转染miR-30b mimic及pCTHRC1-IRES2-EGFP质粒明显提高了miR-30b及CTHRC1水平(t值分别为9.960、25.238，P值均<0.05)(图4a、d)。此外，过表达CTHRC1组中miR-30b水平下降，差异有统计学意义(t=-3.457，P<0.05)(图4b)；miR-30b组与对照组相比，CTHRC1表达水平明显下降(t=-24.677，P<0.05)(图4c)。

注：a，Huh7细胞白光拍摄；b，Huh7细胞荧光拍摄；c，HepG2细胞白光拍摄；d， HepG2细胞荧光拍摄。

图3转染效果验证(×100)

注:a，has-miR-30b-5p mimic (miR-30b)与Negative control (control)转染至293T细胞中miR-30b的表达；b，pCTHRC1-IRES2-EGFP (CTHRC1)质粒与pIRES2-EGFP (NC)质粒转染至293T细胞中miR-30b的表达；c，miR-30b与control转染至293T细胞中CTHRC1的表达；d， CTHRC1质粒与NC质粒转染至293T细胞中CTHRC1的表达。

图4CTHRC1与miR-30b的表达分析

3 讨论

CTHRC1是一种28 kD的细胞外基质糖蛋白，含有作用细胞外分泌的NH2末端信号肽，36个氨基酸的短胶原三螺旋重复序列和COOH末端球状结构域[7]。最近的研究表明，CTHRC1在多种侵袭性肿瘤中上调，包括胃癌[8]、结直肠癌[9]以及胰腺癌[10]。这些研究表明，CTHRC1是肿瘤微环境中肿瘤发展、转移和侵袭的关键调节因子[11]，但其在肝癌中的研究较少。miR-30b在多种肿瘤中表达异常，近年来，在多种肿瘤中发现miR-30b表达下调，如肝癌[12]、非小细胞肺癌[13]、结直肠癌[14]、胃癌[15]、食管癌[16]、乳腺癌[17]、喉癌[18]和神经胶质瘤[19],但其在肝癌进程中的机制尚不清楚。为进一步研究CTHRC1是否为miR-30b的靶标，并对人肝癌细胞的侵袭与转移方面的作用，本研究构建pCTHRC1-IRES2-EGFP 真核表达载体，然后分别将miR-30b mimic、control、pCTHRC1-IRES2-EGFP质粒和pIRES2-EGFP质粒转染至293T细胞中，48 h后检测CTHRC1蛋白及miR-30b的表达水平，结果显示过表达CTHRC1组中miR-30b的表达水平下降(P<0.05)；miR-30b表达升高则导致CTHRC1表达下降(P<0.05)，这些数据提示CTHRC1基因表达与miR-30b的水平呈负相关。需进一步研究明确CTHRC1可能为miR-30b的靶基因，并为下一步研究奠定基础。

脂质体转染通过静电作用与被转染的目的片段相结合，便于携带外源基因入细胞, 而且进入细胞后可被细胞降解, 无明显毒副作用和免疫反应产生[20]；且脂质体转染试剂介导的转染操作简单。miRNA是通过作用于基因的3′非编码区域结合来实现对目标基因的调节，故本实验采用特异性引物PCR扩增含有CTHRC1 CDS+3′UTR区序列的pUC57载体，扩增产物双酶切、回收克隆至pIRES2-EGFP真核表达载体，脂质体介导转染入人肝癌细胞。

本实验中所构建的载体pIRES2-EGFP除具备真核表达载体的一般特征外，还具备以下特点：EGFP基因编码区可表达EGFP，EGFP较野生型的GFP荧光更强，在哺乳动物细胞中有更高的表达，通过荧光显微镜观察转染效率，还可以通过流式细胞仪对阳性细胞进行分选；在多克隆位点与EGFP基因区之间存在IRES区，可以使外源基因和EGFP基因同步表达。因此, 本实验选取该载体构建真核表达载体用于人肝癌细胞的进一步研究。

笔者根据NCBI数据库中的CTHRC1 CDS+3′UTR区合成序列为模板，采用特异性引物PCR扩增并成功将其克隆至pIRES2-EGFP载体中，并对目的片段进行测序，以确保重组载体的质量。重组体被整合到宿主细胞基因组后，通过抗性辅助筛选单克隆细胞，并初步验证了CTHRC1与miR-30b的关系，为下一步检测CTHRC1与miR-30b的相互作用及其在人肝癌细胞的侵袭与转移方面的作用，进而对以CTHRC1为靶点的人肝癌细胞的侵袭与转移的基因治疗提供实验基础。