抗生素相关性腹泻病原菌的检测方法

王 硕，张志华

(承德医学院附属医院 血液科，河北 承德 067000)

广谱抗生素的使用可消灭患者机体的大多数致病菌，但同时也严重破坏了肠道微生态平衡，引发菌群失调甚至二重感染[1-3]，近年对于艰难梭菌相关性腹泻(Clostridiumdifficile-associated diarrhea,CDAD)研究较多，CDAD约占抗生素相关性腹泻(antibiotic-associated diarrhea，AAD)的1/3，但仍有2/3病原菌尚不明确，导致AAD的诊断及治疗仍是临床的一个难题，因此对于抗生素相关腹泻的病原菌检测十分重要，本文就抗生素相关腹泻的检测方法进行综述。

1 AAD的危险因素

研究提示，几乎所有的抗生素均能引起AAD，既往流行病学研究显示导致AAD的危险因素包括：广谱抗生素的应用、患者本身免疫力低下、化疗药物的使用、应用质子泵抑制剂、年龄≥65岁、住院时间长等[4-7]，应注意临床预防。

2 AAD的发生机制和分类

AAD的病理生理学发生机制包括分泌性、动力性、渗出性、渗透性等，临床常按照感染性AAD和非感染性AAD进行分类。

2.1感染性AAD 目前，感染性AAD的原因主要是广谱抗生素的使用导致肠道菌群失衡，致病菌或条件致病菌大量生长繁殖，导致不同严重程度的腹泻，AAD的病原微生物包括艰难梭菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡葡萄球菌、克雷伯杆菌、念珠菌、沙门菌[8]以及无毒梭菌等[9]，CDAD产生肠毒素A和细胞毒素B(分别与tcdA和tcdB基因相关)，临床上，艰难梭菌的表现范围很广，从无症状的携带到严重的、危及生命的暴发性伪膜性肠炎和中毒性巨结肠[10]。

2.2非感染性AAD 非感染性AAD又称功能性AAD，其原因主要为：(1)一方面抗生素可增加胃肠动力引起腹泻，另一方面抗生素的不良反应可引起肠黏膜损害和肠上皮萎缩，进而导致营养物质吸收障碍引起腹泻；(2)抗生素引起肠道正常菌群失调使得代谢功能受损，包括多糖类发酵障碍、糖吸收不良，最终肠内渗透压升高引起渗透性腹泻[11]。

3 AAD的实验室检查

3.1粪便常规的检测 大便常规检测对AAD缺乏特异性，对于腹泻较轻的患者的粪便检测可无异常，而较严重患者检测也只能出现白细胞或红细胞。

3.2便菌群比例 粪便涂片的革兰染色法不仅能直接观察出肠道内菌群数是否产生变化，还能观察出革兰阳性菌与阴性菌的比例及球菌与杆菌的比例是否失调，或有无真菌，由此判断肠道菌群紊乱程度，该方法实用、可靠、经济，可快速对临床下一步治疗提供依据指导治疗。

3.3肠道细菌定量培养法 通过不同培养基的菌落培养，以期对菌数进行计数，对于CDAD的培养，多采用CCFA选择性培养基，但培养阳性率低，而且不能区分产毒性菌株和非产毒性菌株，该方法主要用于流行病学研究，很少用于临床诊断。近年来采用琼脂显色选择性培养基，比CCFA培养基选择性好，艰难梭菌培养阳性率增加了20%，目前仍需大量的研究证实其在临床中的应用价值[12]；毒力生成培养(TC)是在选择性培养艰难梭菌的基础上发展起来的，主要分为2部分，即艰难梭菌培养和毒素检测，通过观察毒素引起的细胞病变和加入中和毒素判断有无产毒菌株，由于TC检测需要时间长，使艰难梭菌感染诊断延迟，另一方面，体外菌株的产毒能力能否准确代表该菌株在体内的情况尚需进一步研究[13]。由于培养方法操作起来耗时多并且肠道菌群种类培养的局限性，因此目前不能将该法用于AAD的诊断。

3.4细胞毒性中和试验(CCTA) CCTA通过检测粪便中毒素B进行诊断，通过观察引起的细胞病变，然后通过特异性抗血清中和试验确定细胞病变的特异性[14]，具有特异度、灵敏度较高等优点，曾认为是艰难梭菌感染检测的“金标准”，但该实验的粪便标本需为新鲜粪便，如果粪便放置太久导致毒力减退可引起假阴性结果，另外，该技术要求高、花费时间长，尚未得到广泛应用。

3.5谷氨酸脱氢酶(GDH)实验 粪便GDH检测方法灵敏度高，特异度中等，出结果快，价格便宜，操作简单，在临床实验室易于执行，但GDH是艰难梭菌菌株表面的一种共同抗原，产毒性和非产毒性艰难梭菌菌株都可产生，不能区分产毒性和非产毒性艰难梭菌,需要联合毒素测试来诊断艰难梭菌感染[15]，GDH阴性样本可排除，GDH阳性样本仍需要进行毒素测试来确定。

3.6竞争性酶免疫分析(EIA)毒素检测 EIA毒素检测是最早应用于艰难梭菌感染临床检测的方法，具有操作简单、出结果快、价格便宜、特异度高等优点，但因灵敏度较低在临床诊断中价值有限。EIA检测毒素的灵敏度约为45%。与艰难梭菌培养相比，EIA检测毒素灵敏度及阳性预测值较低，可能造成轻中度艰难梭菌感染漏诊，而且不能对毒素基因和核糖体型进一步分析。综上，结合GDH的两步法和三步法可提高CDAD诊断的准确率[16]。

3.7核苷酸扩增检测(NAAT) 实验室常用的NAAT检测方法包括常规聚合酶链反应(PCR)、实时PCR、环介导恒温扩增法(LAMP)。NAAT灵敏度和特异度均较高，并且操作简单、出结果快，但价格较毒素EIA较贵。与GDH检测和EIA毒素测试比较，NAAT能更快、更准确诊断艰难梭菌感染。然而，仅可检测具有产毒素潜能的艰难梭菌毒素基因，而不是直接检测艰难梭菌毒素，因此检测结果会出现假阳性[17]。

3.8结肠镜检测 结肠镜检查对绝大部分AAD无特异性，仅可以发现假膜性肠炎(PMC)患者结肠的特异性病变即结直肠黏膜上可见2～10 mm微黄色的斑块，文献[18]报道,PMC与抗菌药物的使用相关，即便结肠镜检查是鉴别PMC的最佳方法，但该操作可能增加感染和肠穿孔风险。

3.9实时荧光定量PCR 1992年Higuchi等首次采用动态PCR和封闭式检测方法对目的核酸数量进行实时分析，最初是将荧光计和PCR仪连接，在反应管中加入与双联DNA分子结合而发射荧光的燃料，在PCR扩增过程中，随扩增产物不断增加，与扩增产物结合的染料所产生的荧光也不断增强，可通过荧光计检测到的荧光强度估算扩增产物量，目前实时荧光定量PCR所使用的荧光化学方法主要有荧光探针TaqMan、荧光探针-分子信标、荧光染料-SYBRGreen、荧光引物LUX等，随着分子生物学技术的发展,实时荧光定量PCR法因其简便快捷、可定量、重复性好、灵敏度高、特异度高及PCR反应后不需要电泳检测等优点,广泛应用于遗传性疾病的诊断、肿瘤分子的诊断、病原体检测，由于完全闭管操作，可以克服PCR反应过程中污染造成假阳性结果，可用于检测复杂微生物环境，目前已成为肠道微生态研究中重要的分子生物学技术方法之一，李芬[19]通过比较实时荧光定量PCR法与常规细菌鉴定法检测肠道致病菌的对比研究中发现实时荧光定量PCR的阳性率更高，另一方面PCR技术避免了细菌接种培养-生化鉴定-血清学鉴定的不足，其主要针对细菌DNA进行检测，该方法被国内外学者广泛应用于追踪、检测细菌性腹泻，为临床早期诊断和治疗提供了依据[20]，虽然该技术受到检测范围的限制(仅限于细菌或真菌甚至更有限的范围，取决于所用的引物)以及灵敏度的影响[21]，不利于我们更加深入的了解AAD，但在一定程度上有利于我们指导临床治疗。

3.10基于宏基因组的二代测序技术(metagenomic next-generation sequencing,mNGS) 目前，上述检查方法无法全面、具体分析AAD的肠道菌群，mNGS应运而生，近十年来，世界各国启动“人类微生物计划”和“地球微生物组计划”，2015年10月，美国科学家在Science呼吁实施“联合微生物研究计划(UMI)”，与此同时，我国科学家联合美、德两国科学家在Nature提出成立“国际基因组计划”，得益于mNGS的发展，我们可以更全面的了解微生物群落特点，该技术的原理是将DNA(cDNA)随机片段化、加接头，制备测序文库，通过对文库进行延伸反应，检测相应的信号从而获取文库信息，具体实验流程包括样品的准备、DNA的提取和检测、PCR的扩增及产物纯化、文库制备和库检、Miseq测序。mNGS是目前常用的测序技术，以illumina公司的Soiesa为代表，因其能够检测标本中存在的所有DNA或RNA，故而能够分析患者标本的整个微生物组以及人宿主基因组及转录组，所以被广泛应用于微生物的研究，例如肠道微生态中物种多样性和丰富度的菌群分析[22]，mNGS首次用于感染性疾病的诊断报道于2014年关于1例中枢神经系统钩端螺旋体病患者的临床诊断,基于mNGS的临床诊断指导抗生素的使用从而使患者最终恢复健康，该病历首次证明了mNGS可以为临床诊断提供依据[23]，此后不断有个案报道，刘桂等[24]通过二代基因测序技术成功分析应用中药汤剂葛根芩连汤后对2型糖尿病患者肠道菌群变化的影响。Nobel等[25]通过mNGS研究发现幼年小鼠应用抗生素后对肠道菌群、机体生长和代谢产生影响，进而研究儿童早期应用抗生素对机体的影响，目前，越来越多mNGS提供的数据被广泛应用于临床，mNGS可以对包括病毒、细菌、真菌或寄生虫等多种病原体检测，根据DNA和(或)RNA序列直接对粪便标本进行鉴定[26]，具有绝对的优势，mNGS的另外一个关键优势是测序数据可以对除了致病病原体之外的潜在病原体进行分析，例如微生物组特征和通过RNA测序的转录组分析对人类宿主反应的平行分析，以预测感染原因和评估疾病风险[27-28]。尽管如此，mNGS仍面临巨大的挑战，尤其对于免疫功能低下患者，因其潜在病原体范围更广，故无法区分污染物、定植菌及致病菌，导致最终的诊断结果必须依靠于临床，而且，mNGS目前缺乏通用参考标准及临床测定质量保证，此外，限制其临床应用的因素还包括成本、报销等。尽管目前该技术存在很多局限性，但将来mNGS必将成为AAD诊断的关键驱动因素，从而推进临床诊断及精准医疗的发展。

综上，临床上虽然可以利用各类益生菌制剂预防和治疗AAD，但治疗效果一般，而且前期诊断的方法还尚不完善，需要更加深入地认识肠道菌群与AAD的关系从而寻找灵敏度、特异性较高的诊断方法。