右美托咪定上调PI3K/AKT通路促进骨髓间充质干细胞增殖的作用机制

于 芝，汪 婷，徐卉芳

随着我国工业及交通事业的迅猛发展以及人口老龄化的发展，骨折已成为目前临床中最常见的疾病，骨髓间充质干细胞(BMSCs)在骨折愈合中起着关键作用。右美托咪定具有镇静、镇痛、稳定血流动力学、无呼吸抑制作用等优点，目前被广泛应用于麻醉、ICU等领域[1]。相关研究表明，右美托咪定可以通过上调PI3K/AKT通路产生促增殖、抑制细胞凋亡、抗炎等作用[2-4]，但右美托咪定是否通过PI3K/AKT通路影响BMSCs增殖目前尚无文献资料报道。

1 资料与方法

1.1 一般资料：人骨髓间充质干细胞购自中国科学院昆明细胞库，干细胞培养基购自Thermo Scientific公司，PI3K/AKT通路抑制剂LY294002购自MCE公司，右美托咪定购自江苏恒瑞医药股份有限公司。

1.2 细胞培养：人骨髓间充质干细胞在5% CO2、37 ℃培养箱培养，干细胞培养基参照试剂使用说明配置使用，当细胞融合达到80%左右进行传代。

1.3 实验分组：处于对数生长期细胞依照细胞处理方式，分为：①对照组，细胞正常培养；②Dex组，细胞培养液中加入1 nM/L[5]右美托咪定;③抑制剂组，细胞加入10 mmol/L[6]抑制剂LY294002 15 min后加入1nM/L右美托咪定。

1.4 细胞周期检测：参照凯基(KGA512)细胞周期检测试剂盒说明书，收集细胞，染色，流式细胞仪检测，用ModFit LT软件分析数据。

1.5 Western Blotting：细胞在裂解液中裂解，离心收集上清液，定量上清液中的总蛋白浓度，加热,变性；4%～12% Bis-Tris凝胶电泳,转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h；加入一抗(4 ℃孵育过夜)，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，ECL发光检测，采用ImageJ软件进行相对定量分析。

2 结果

2.1MTT细胞增殖检测：细胞增殖检测Dex组24、48 h细胞OD值明显高于对照组，差异有统计学意义；抑制剂组24、48 h 细胞OD值明显低于Dex组，差异有统计学意义，见图1(目录后)。

2.2 细胞周期检测：细胞周期检测Dex组细胞G1期(47.43±0.32)、S期(28.21±0.42)细胞比例，低于对照组的G1期(52.41±0.32)、S期(32.83±0.75)，差异有统计学意义(t=为23.26、9.32，P<0.05)；G2期细胞(24.36±0.26)分布比例高于对照组(14.75±0.44)，差异有统计学意义(t=32.46，P<0.05)；抑制剂组细胞G1期(67.91±0.57)细胞比例高于Dex组，差异有统计学意义(t=59.46，P<0.05)；G2期(3.36±0.14)细胞分布比例低于Dex组，差异有统计学意义(t=125.79，P<0.05)。

2.3 细胞增殖蛋白检测：Western Blotting检测细胞增殖蛋白表达，DEX组CCNB1、CDC2蛋白表达较对照组上调，抑制剂组CCNB1、CDC2蛋白表达较Dex组下调，见图2(目录后)。

2.4 PI3K/AKT通路蛋白表达情况：Western Blotting检测PI3K/AKT通路蛋白表达，DEX组PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达较对照组上调，抑制剂组PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达较Dex组下调，见图3(目录后)。

3 讨论

骨形成包括两个重要的过程，即膜内成骨导致扁平骨和软骨内成骨形成长骨。BMSCs具有多能性，可分化为多种细胞类型，包括软骨细胞和成骨细胞[7]，分别用于软骨内成骨和膜内成骨[8]。BMSCs对骨再生也至关重要，骨愈合的关键一步是BMSCs定位到损伤部位[9]。BMSCs在骨折愈合的各个阶段发挥其再生功能，骨折早期BMSCs能有效抑制白细胞介素1 (IL-1)、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)等炎性因子分泌，加速纤维性愈伤组织的形成；在骨折后期MSCs到达骨折内膜，通过促进BMP2的表达加速骨痂的形成和愈伤组织的重塑[10]。

右美托咪定目前被应用为一线镇静剂及包括骨科手术在内的各类麻醉辅助用药[11-12]。本结果显示，研究Dex组细胞G2期细胞比例明显增加，CCNB1、CDC2蛋白表达较对照组上调，抑制剂组细胞增殖明显受到抑制，同时CCNB1、CDC2蛋白表达下调。文献资料显示细胞周期G2/M检查点调控细胞增殖方面具有重要作用，可防止DNA损伤的细胞进入有丝分裂，CDC2-CCNB复合物为调节G2/M检查点的关键因素，上调CCNB1、CDC2可促进细胞进入G2期，加快细胞有丝分裂进程[13]。表明右美托咪定通过上调CCNB1、CDC2蛋白表达促进细胞进入G2期，进而促进BMSCs细胞增殖。

有研究表明，PI3K/AKT通路在维持BMSCs增殖及功能方面具有重要作用[14-15]。本研究结果显示，Dex组PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达较对照组上调，而加入PI3K/AKT通路抑制剂后PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达较Dex组显著下调，同时细胞增殖受到抑制，表明右美托咪定通过上调BMSCs细胞PI3K/AKT信号通路促进BMSCs细胞增殖。