SIRT1对大鼠血管平滑肌细胞衰老的影响

李书国， 童 格，叶 明，邓娟娟，邵 文

1)三峡大学老年医学研究所 湖北宜昌 443003 2)宜昌市中心人民医院老年病科 湖北宜昌 443003

血管平滑肌细胞衰老与多种心血管系统疾病的发生有关，动脉粥样硬化、脑卒中等疾病发生时均伴随有血管平滑肌细胞衰老[1]。血管平滑肌细胞分布于动脉中层，血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)能够诱导血管平滑肌细胞衰老，导致血管组织功能障碍[2]。沉默信息调节因子1(silence information regulator 1,SIRT1)是Sirtuin蛋白家族的成员之一，具有调控细胞代谢、抵抗应激、调控胚胎发育等多种作用，在成人及胚胎组织中广泛表达[3]。研究[4-6]显示，SIRT1具有抵抗衰老相关疾病的作用，在神经退行性疾病、心血管系统疾病中发挥保护作用；SIRT1能够抑制内皮细胞衰老。本实验采用Ang Ⅱ诱导血管平滑肌细胞衰老，探讨SIRT1过表达对血管平滑肌细胞衰老的影响，为明确SIRT1在动脉粥样硬化血管平滑肌细胞衰老中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1实验动物和主要试剂6周龄SD雄性大鼠25只，体重150～180 g，购自三峡大学实验动物中心。β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自美国Cell Signaling Technology公司，P21抗体购自美国Santa Cruz公司,Ang Ⅱ购自美国Millipore公司，P53抗体购自美国Abcam公司，HRP标记的二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司，SIRT1抗体购自上海士锋生物科技有限公司，PI细胞周期检测试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司，PCR试剂购自美国Invitrogen公司；SIRT1过表达慢病毒载体(Lv-SIRT1)和阴性对照慢病毒载体(Lv-NC)由上海锐赛生物技术有限公司构建。

1.2血管平滑肌细胞的分离培养[7]SD雄性大鼠断颈处死，取胸腹主动脉，剔除脂肪及血管外膜后剪碎，转移至细胞培养瓶内，加入含有体积分数20%胎牛血清的DMEM培养液，置37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内培养，5 d后去除组织块，加含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液。取第3代细胞进行以下实验。

1.3细胞分组与转染取对数生长期细胞分为对照组、Ang Ⅱ组、Ang Ⅱ+Lv-NC组、Ang Ⅱ+Lv-SIRT1组，每组3个复孔。Ang Ⅱ+Lv-NC组、Ang Ⅱ+Lv-SIRT1组细胞分别转染阴性对照慢病毒载体和SIRT1过表达慢病毒载体；Ang Ⅱ组、Ang Ⅱ+Lv-NC组、Ang Ⅱ+Lv-SIRT1组给予100 nmoL/L的Ang Ⅱ培养液培养，诱导细胞衰老；按照常规方法进行慢病毒转染，MOI=30，转染后3 d观察其转染效率高于90%。设置仅用培养液培养的细胞为对照。

1.4qRT-PCR检测SIRT1mRNA表达水平取各组细胞培养2 d后，加入Trizol提取细胞中的总RNA，步骤同试剂盒说明书。DEPC水溶解RNA。用cDNA合成试剂盒进行反转录。以SYBR进行qRT-PCR。引物序列：SIRT1上游5’-CGGCTGCCA CAGCGTCAT-3’，下游5’-ACAATCTGCCACAGGGT CAT-3’；GAPDH上游5’-ACAACTTTGGCATTGTG GAA-3’，下游5’- GATGCAGGGATGATGTTCTG-3’。反应条件：94 ℃，10 min；94 ℃，20 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s，共40个循环，根据目的基因的Ct值，用公式2-ΔΔCt计算SIRT1表达水平。

1.5Western blot法检测SIRT1蛋白表达水平取各组细胞培养2 d后，添加150 μL的RIPA裂解液，置冰上裂解15 min。4 ℃高速离心，吸取上清，用BCA法定量。配制100 g/L的分离胶和50 g/L的浓缩胶。每个上样孔中添加40 μg蛋白样品，80 V电压电泳30 min，蛋白电泳至分离胶和浓缩胶的分界处，调整电压到120 V，蛋白电泳至距离底部边缘约1 cm时，停止电泳。将PVDF膜裁剪成凝胶大小，浸泡于转移缓冲液中30 min，300 mA的电流转膜50 min。PVDF膜经过50 g/L脱脂奶粉封闭以后，浸泡于1∶1 000稀释的一抗和1∶4 000稀释的二抗中进行结合反应，ECL发光，Image J扫描。GAPDH作为内参，以SIRT1与内参条带灰度值的比值作为SIRT1蛋白的表达水平。

1.6β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老取各组细胞培养2 d，PBS洗涤，每孔加1 mL固定液，室温下固定10 min，PBS洗涤，添加β-半乳糖苷酶染色液，以膜封板后，37 ℃孵育过夜。显微镜下观察，蓝色细胞为阳性细胞，计算阳性细胞占总细胞数目的百分比。

1.7Western blot法检测细胞中P21、P53蛋白的表达取各组细胞培养2 d后，采用Western blot法检测细胞中P21、P53蛋白水平，步骤同1.5。

1.8PI单染法检测细胞周期取各组细胞培养2 d后，添加体积分数70%的乙醇溶液，4 ℃过夜。离心后，收集细胞，添加含有50 mg/L PI的PBS溶液500 μL，4 ℃反应30 min。上流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

1.9统计学处理采用SPSS 21.0分析，各组血管平滑肌细胞中SIRT1的表达、β-半乳糖苷酶阳性率、P21、P53蛋白表达和细胞周期分布的比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组血管平滑肌细胞中SIRT1表达的比较见表1。

表1 各组血管平滑肌细胞中SIRT1表达的比较(n=3)

2.2各组血管平滑肌细胞中β-半乳糖苷酶阳性率和P21、P53蛋白表达水平比较见表2和图1。

表2 各组血管平滑肌细胞中β-半乳糖苷酶阳性率和P21、P53蛋白表达水平比较(n=3)

1～4：分别为对照组、Ang Ⅱ组、Ang Ⅱ+Lv-NC组、Ang Ⅱ+Lv-SIRT1组

2.3各组血管平滑肌细胞周期分布比较见表3。

表3 各组血管平滑肌细胞周期分布比较(n=3) %

3 讨论

动脉粥样硬化是多种心血管系统疾病发生的基础，而血管平滑肌细胞衰老是动脉粥样硬化发生的早期标志[8]。血管平滑肌细胞在动脉粥样硬化发生时迁移至内膜，并在坏死泡沫细胞周围聚集，形成纤维帽，进而诱发动脉粥样硬化斑块的产生[9-10]。Ang Ⅱ是动脉粥样硬化发生的诱导因子，可以诱导血管平滑肌细胞衰老[11-12]。本研究结果显示，Ang Ⅱ处理后的血管平滑肌细胞β-半乳糖苷酶阳性率升高，提示成功构建了血管平滑肌细胞体外衰老模型。

SIRT1是存在于哺乳动物体内的与Sir2同源的保守蛋白，在人体骨骼肌、脑、心脏等组织中的表达水平最高，在胰腺、卵巢、肾脏等组织中也有不同程度的表达[13-14]。SIRT1具有抵抗氧化应激、减少细胞凋亡等多种作用，其在动脉粥样硬化组织中表达下调；SIRT1表达水平与总胆固醇、低密度脂蛋白水平呈负相关[15-16]。在肝癌细胞、血管内皮细胞、胰岛β细胞等多种细胞中SIRT1与细胞能量代谢和寿命有关[17-19]。本实验结果显示，SIRT1过表达可以抑制Ang Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞衰老，提示SIRT1在动脉粥样硬化血管平滑肌细胞衰老中发挥抑制作用。

P21、P53是细胞衰老的标志蛋白[20]。有研究[21]表明，SIRT1具有去乙酰化P53蛋白的第382个赖氨酸残基的作用，SIRT1可能通过抑制P53蛋白的表达抑制下游靶基因的转录和激活。P21是P53的下游靶基因，细胞内P53表达下调可以抑制P21的表达。P21还是一种细胞周期抑制因子，可以抑制细胞周期蛋白E活性，使细胞周期停滞在G1期，而细胞G1期向S期转变是细胞衰老的特征之一[22]。本实验的结果显示，衰老诱导后的血管平滑肌细胞中P21、P53蛋白表达水平升高，G0/G1期细胞比例升高；SIRT1过表达细胞中P21、P53蛋白表达水平降低，G0/G1期细胞比例降低。以上结果提示SIRT1可能通过降低P53、P21蛋白表达减轻Ang Ⅱ对血管平滑肌细胞周期的阻滞作用。

总之，SIRT1参与动脉粥样硬化血管平滑肌细胞衰老的发生，SIRT1过表达能够抑制Ang Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞衰老，可能与细胞中P53和P21表达下调，促进细胞从G1期向S期转变有关。本实验结果为研究SIRT1调控动脉粥样硬化血管平滑肌细胞衰老机制奠定了基础，为研究动脉粥样硬化分子发病机制提供了参考。