猪伪狂犬病gE、gB抗体镧系荧光免疫层析快检试剂盒的研制及效果评估

王泽洲，陈弟诗，张毅，吴俊清，章健，贺冬梅

（1.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；2.成都微瑞生物科技有限公司，四川 成都 611731）

猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒（PRV）引起的一种传染病，妊娠母猪发病后可发生流产、死胎、木乃伊胎；哺乳猪和保育猪发病后，可出现神经症状和呼吸道症状，感染猪日龄越大死亡率越低；育肥猪和成年猪发病后，可出现发热和呼吸道症状，耐过猪可终身带毒，成为病原贮存宿主。我国自1947 年首次报道猪感染伪狂犬病毒以来，已有20 多个省市相继发生过本病，猪群的平均阳性率达20%以上［1］。猪伪狂犬病防控和净化的核心技术是基因缺失（标记）疫苗和鉴别诊断方法的研究和应用。目前我国猪场中使用的基因缺失疫苗有Bartha 株、HB98 株、SA215 株和BUK株。伪狂犬病毒野毒抗体的检测常使用gEELISA试剂盒，免疫抗体的检测常使用gB-ELISA试剂盒和灭活全病毒抗原的ELISA 试剂盒。由于ELISA 抗体和免疫保护力关系不强，用胶体金法检测抗体又存在敏感性不高，凭肉眼观察存在主观臆断、准确性低等问题，因此，本研究应用镧系元素作荧光标记物研制了一种既具有金标层析技术简单、方便、快捷，又具有ELISA 准确、特异、敏感等优点的猪伪狂犬病抗体镧系荧光免疫层析快检试剂盒（PRV-LFICA）。

1 材料与方法

1.1 材料 PRV-gE 和PRV-gB 表达蛋白抗原、兔抗鸡IgY 抗体、鸡IgY 抗体，镧系荧光纳米微球和Wellray®WR-1608 荧光仪，吸水纸、样品垫、硝酸纤维素膜，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），N-羟基琥珀酰亚胺，切条机、点膜和喷金膜机，其他试剂均为国产分析纯。猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒2 型（PCV-2）、猪繁殖与呼吸道综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的阳性血清，猪伪狂犬病毒gB 抗体ELISA 检测试剂盒，猪伪狂犬病毒gE抗体ELISA检测试剂盒。

此外，制备包被膜、抗原标记微球、夹心法建立等均参照说明书或按相关要求操作。

1.2 荧光免疫层析试纸条的组装 在湿度小于30%，温度20～25 ℃的环境下，把吸水纸、标记物垫和样品垫按顺序粘贴在聚氯乙烯底板上形成微反应体系，然后将其切割成0.5 cm宽，即成试纸条，将试纸条装入卡壳中制成检测卡，装入铝箔袋封存备用。

1.3 特异性试验 以建立的判断标准（标准曲线）与CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV、JEV、PEDV、TGEV的阳性血清进行猪伪狂犬病抗体镧系荧光免疫层析检测，同时设猪伪狂犬病毒血清阳性和阴性对照，以确定该试验方法是否发生交叉反应。

1.4 敏感性试验 将PRV 标准阳性血清按1∶40、1∶160、1∶640、1∶2 560、1∶10 240、1∶40 960 倍比稀释，每个稀释度平行做4个重复，用上述组装好的PRV-LFICA 试剂卡检测，将结果换算成T∕C值，判断抗体检出效价。

1.5 重复性试验

1.5.1 批内重复性试验 在相同条件下选取12份PRV 抗体水平不同的血清，每份样本平行做8个重复，用组装的PRV-LFICA 试剂卡检测（批号为20170831），然后对检测结果进行统计学分析。

1.5.2 批间重复性试验 在相同条件下选取12份PRV 抗体水平不同的血清，分别用4 批PRVLFICA 试剂卡检测（批号分别为20180717、20181023、20181211、20190216），然后对检测结果进行统计学分析。

1.6 比较试验 分别取猪伪狂犬病毒gB抗体高敏荧光免疫层析法试剂卡和猪伪狂犬病毒gB 抗体ELISA检测试剂盒，同时检测临床样品200份，操作方法与结果判定按说明书进行。再分别取猪伪狂犬病毒gE 抗体高敏荧光免疫层析法试剂卡和猪伪狂犬病毒gE 抗体ELISA 检测试剂盒，同时检测临床样品200份，操作方法与结果判定也按说明书进行。

1.7 试剂盒的组装及保存期试验 PRV-LFICA 试剂盒由荧光检测仪、检测卡、连接线组成。试剂盒置4 ℃保存，于保存后60、120、180、240、300、360、420、480 d按照PRV-LFICA的各个优化条件，对PRV 阳性和阴性参考血清进行检测，并对结果进行统计学分析。

1.8 应用试验 应用本次研制的PRV-LFICA试剂盒检测收集自四川省内各地的1782份样本，了解PRV血清抗体阳性率。

2 结果

2.1 测定条件的选择 按照镧系荧光免疫层析法的操作步骤，选择标记量比例为1∶25的免疫微球；以样本稀释倍数40 倍为加样量；检测时间选择为加样后15 min。

2.2 检测结果的判读 加样后，由于层析作用液体向前移动，先后与包被在T 线和C 线上的抗原形成复合物，这时试纸条经荧光检测设备扫描显示出2条荧光带。C线荧光扫描值基本一致，T线值随加样中抗体浓度的增加而升高。相应的检测结果以浓度为横坐标，荧光值信号为纵坐标，经对数函数数据处理程序拟合即得到标准曲线。当样本为阴性时，PRV抗体浓度很低，T线荧光值很低或完全检测不到；当样本为阳性时，PRV 抗体浓度越高，T 线荧光值也越高。无论结果是阳性还是阴性，C线总能显示荧光，如果C线没有荧光显现，无论T线有无，结果均判为无效。

2.3 特异性试验 本次用PRV-gE和PRV-gB蛋白分别建立的PRV-gE-LFICA 和PRV-gBLFICA 试剂盒检测7 种常见猪病的阳性血清，得到的荧光比值均低于0.35（表1、表2），呈阴性反应。表明PRV-gE-LFICA 和PRV-gB-LFICA 试剂盒与7 种常见猪病的阳性血清不发生交叉反应，PRV-gE-LFICA 试剂盒对gB阳性血清，PRVgB-LFICA试剂盒对gE阳性血清也不发生交叉反应，显示出很好的特异性。

表1 PRV-gE交叉反应试验结果

表2 PRV-gB交叉反应试验结果

2.4 敏感性试验 把PRVgB 和PRV-gE 标准阳性对照血清稀释至2 560 倍，镧系荧光检测结果仍为阳性。用同一份阳性血清分别同时做ELISA 和PRV-gB-LFICA、PRV-gE-LFICA检测，结果显示：PRV-gB-LFICA、PRVgE-LFICA 比ELISA 检 测 结果高1～2个滴度。表明该方法敏感性很好。

2.5 重复性试验 批内重复性试验的变异系数均小于10%（表3、表4），批间重复性试验的变异系数也均小于10%（表5、表6）。表明PRV-gE-LFICA 和PRV-gBLFICA 试剂盒具有良好的重复性。

表3 PRV-gB-LFICA批内重复性试验结果

表4 PRV-gE-LFICA批内重复性试验结果

表5 PRV-gB-LFICA批间重复性试验结果

表6 PRV-gE-LFICA批间重复性试验结果

2.6 比较试验 用PRVgB-LFICA试剂盒和gB-ELISA试剂盒同时检测临床样品200 份，其中PRV-gB-LFICA检出阳性139 份，阴性48 份，可疑13 份；gB-ELISA 检出阴性47 份，阳性152份，可疑1 份。两种检测方法的总符合率为89%（表7）。

用PRV-gE-LFICA 和gE-ELISA 试剂盒同时检测临床样品200 份，其中PRV-gE-LFICA 检出阳性13 份，阴性187 份；gE-ELISA 检出阴性188份，阳性12 份。两种检测方法的总符合率为97.5%（表8）。

表7 gB-ELISA和PRV-gB-LFICA试剂盒检测200份临床样品的结果

表8 gE-ELISA和PRV-gE-LFICA试剂盒检测200份临床样品的结果

2.7 保存期试验 统计学分析表明（表9、表10），PRV-gE-LFICA 和PRV-gB-LFICA 试剂盒在保存480 d 后检测阳性血清、阴性血清，T∕C 值的变异系数均小于10%，说明该试剂盒在保存12个月后仍然稳定有效，进一步的稳定性试验还在进行中。

表9 PRV-gB-LFICA保存期试验结果

表10 PRV-gE-LFICA保存期试验结果

2.8 现场应用试验 使用本次研制的PRV-gELFICA和PRV-gB-LFICA试剂盒检测收集自四川省内各地的样本1 782 份，结果检出血清gB 抗体阳性1 551 份，免疫抗体阳性率为87.0%；检出血清gE抗体阳性39份，野毒抗体阳性率为2.19%。

3 讨论

3.1 本研究采用镧系元素铕（Eu）作为荧光物质，与传统荧光物质相比，铕具有独特的荧光光谱特性：Stokes位移大，激发光谱宽，发射光谱窄，荧光寿命很长［2-3］。由此建立的荧光方法特异性更强、敏感性更高，检测结果更准确可靠。荧光纳米微球的大小和均匀度也是影响快检试剂盒检测效果的重要因素，本试验用的微球粒径为70～200 nm。微球表面经过羧基（或氨基）活化处理，易与蛋白或抗体共价偶联，能牢固地结合，提高标记物的稳定性，提高蛋白质的包被量，从而大大提高标记效率和灵敏度。

3.2 在猪伪狂犬病常用检测方法中，病毒分离鉴定与中和试验是经典方法，但由于涉及细胞繁殖、病毒培养、染色标记等复杂操作，加之检测周期长，对实验仪器和操作人员技术水平的要求也较高，故很难在基层和普通实验室推广应用。ELISA 是目前应用最广、发展最快的免疫检测技术，是目前检测动物疫病抗体的主要方法。所有的ELISA 都具有敏感性和特异性强、操作简单、检测相对快速、检查微量、无辐射、高通量等优点，但需要比较完整的实验设备，操作人员需要有一定的专业技术水平和经验，检测一批样品的整个流程至少需要2～4 h，对于基层兽医站和一般养殖场不适用。胶体金免疫层析法（GICA）是近年来发展起来的一种快速检测方法，操作简单，使用方便，不需要特殊仪器设备，肉眼直接观察和判定结果，全程只需要几分钟，但敏感性、重复性不高，产品质量参差不齐，漏检率和误诊率较高[4-5]。

本研究建立的PRV-LFICA 检测方法，既具有胶体金免疫层析法（GICA）简单方便、适于基层等优点，通过专用设备检查克服了主观臆断，采用镧系元素作荧光标记克服了产品质量的不稳定性；又具有ELISA敏感、特异、微量等优点，克服了其缺点，检测时间从2～4 h缩短到十多分钟，检测不需要有经验的专业技术人员，检测设备小巧便于携带，尤其适用于基层兽医部门、养殖场和技术服务人员。从PRV-LFICA 方法学评估可以知道，该方法的特异性、敏感性和重复性都较好，与国内ELISA 试剂盒检测结果的符合率和敏感性都在90%以上，表明该方法完全可以用于PRV 免疫抗体的检测和野毒抗体的监测。