绵阳地区山羊粪便中捻转血矛线虫的分子鉴定

蒲善秋，简克灵，李波，谢跃，何冉，杨光友，古小彬*

（1.四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130；2.四川省绵阳市动物疫病预防控制中心，四川 绵阳 621000）

捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）主要寄生于山羊等家养和野生反刍动物的真胃，是反刍动物胃肠道寄生虫中致病能力最强的线虫之一，感染率高（6.5%～96%），死亡率也比较高（40%）[1]。传统形态学方法对于形态相近的寄生虫虫卵和幼虫阶段的鉴定具有局限性[2]，现通常应用分子生物学方法进行虫种鉴定[3-4]。核糖体第二内转录间隔区（rDNA ITS-2）基因的进化速度快，物种内高度保守，而在亚种间具有不同程度的差异[5]，已应用于圆线虫的分类鉴定[6]。本研究采用PCR 技术对山羊粪便中疑似血矛属线虫虫卵的ITS-2基因（粪便样本来自绵阳市北川、盐亭、三台三个县）进行分子鉴定和序列多态性分析，为绵阳地区山羊捻转血矛线虫的分子流行病学调查和种群遗传研究提供科学数据。

1 材料与方法

1.1 样品 绵阳地区三个县疑似有血矛属线虫虫卵的山羊粪便样品60 份，其中盐亭县23 份（YT1-YT23），北川县15 份（BC1-BC15），三台县22份（ST1-ST22）。

1.2 试验方法

1.2.1 虫卵收集与保存 根据镜检结果，采用饱和盐水漂浮法收集上述粪便样品中的虫卵，虫卵经清水反复漂洗后，收集于1.5 mL EP管内，保存于-20 ℃待用。

1.2.2 ITS-2基因的扩增与PCR产物纯化回收 将收集的虫卵根据QIAamp®DNA Stool Mini Kit试剂盒说明书进行DNA 提取，然后将洗脱的DNA 置于-20 ℃冰箱保存备用。引物序列参考Bott等的文献报道[7]，序列如下：P1为5′-CAAATG⁃GCATTTGTCTTTTAG-3′，P2为5′-TTAGTTTCTT TTCCTCCGCT-3′，引物由英潍捷基生物技术有限公司合成。

25 μL PCR 扩增反应体系为：上下游引物（20 pmol）各1 μL，模板DNA 1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，灭菌双蒸水9.5 μL。蒸馏水作为空白对照模板。PCR 扩增反应条件：94 ℃4 min；94 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃30 s（共30个循环）；最后72 ℃延伸10 min。将PCR 反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。扩增条带大小与预期结果相符，将目的条带切割下来，装入1.5 mL灭菌离心管中，根据天根公司DNA纯化回收试剂盒的说明书，进行PCR产物胶回收纯化。

1.2.3 克隆与测序 将上述纯化的PCR 产物连接到PMD19-T 载体，将连接产物全部转入30 μL DH5α感受态细胞中，最后将菌液涂布于含Amp的LB固体培养基，挑取单个菌落，进行菌液PCR 鉴定。取PCR 鉴定为阳性的菌液送英潍捷基生物技术有限公司测序。

1.2.4 序列分析 用MEGA5.0 软件计算测序所得序列的各个碱基（A、T、C、G）组成的含量，将所得的测序序列根据序列是否一致进行分类，序列完全一致的归为一种类型，否则归为不同类型。将不同类型的ITS-2序列与GenBank中各国的捻转血矛线虫和柏氏血矛线虫的ITS-2序列进行比较分析。所有序列用BioEdit 进行人工辅助校对剪切，然后通过MegAlign软件进行序列同源性分析。采用MEGA 5.0软件构建ML系统发育树，同时进行1 000次的自举检验（Bootstrap test）。

2 结果

2.1 PCR 扩增结果 60 份疑似血矛属线虫卵的粪便样品均能特异性地扩增出约300 bp 的基因片段，与预期目的片段的长度大小相符，扩增的目的片段单一清晰（图1）。

2.2 序列特征 测序结果显示，60 份疑似血矛属线虫卵的粪便样品均得到部分265 bp的ITS-2基因片段和部分74 bp 的28S 基因片段。经比对和编辑后，得到ITS-2基因片段长度均为191 bp，60 条序列的A、T、C、G 碱基平均含量分别为29.5%、36.2%、15.4%、18.9%，A+T 碱基含量（65.7%）显著高于G+C 碱基含量（34.3%）。60 份ITS-2 序列共含有174 个保守位点，17 个变异位点（占8.90%，且全部为单变异位点），存在2个转化位点，14个置换位点，1个样品在第140位点存在碱基缺失（表1）。

图1 山羊捻转血矛线虫ITS-2基因部分PCR产物

测序所得的60条序列共有15种不同的基因序列，将这15 种不同的序列命名为H1～H15。7个 样 品（BC1、BC8、BC13、BC15、YT22、YT23、ST15）归类为H1，25 个样品（BC2、BC4、BC7、BC9、BC11、ST4、ST5、ST8、ST9、ST10、ST14、ST17、ST19、ST22、YT1、YT2、YT7、YT8、YT9、YT11、YT14、YT15、YT16、YT17、YT21）归类为H2，15 个样品（BC3、BC5、BC6、BC10、BC12、BC14、YT5、YT6、YT10、YT12、YT19、ST1、ST6、ST12、ST16）归类为H3，2 个样品（ST7、ST20）归类H6，余下的H4～H5和H7～H15各类型仅包含1个样本（表1）。

2.3 ITS-2 基因序列同源性分析 所得15 种类型的ITS-2部分序列与GenBank上相关分离株的同源性为97.4%～100%，与捻转血矛线虫日本分离株（AB682687）的同源性为95.8%～99.0%，与马来西亚分离株（AY647245）的同源性为96.0%～99.5%，与意大利分离株（FN432336）、美国分离株（EU084691）、也门分离株（HQ683715）的同源性均在96.4%～99.5%，与法国分离株（AJ577465）的同源性为97.4%～99.5%，与中国内蒙古分离株（HQ844231）的同源性为97.4%～100%。对所得60 条血矛线虫的ITS-2 序列进行分析后发现：不同虫株间序列的差异性较低，且不同地区的虫株有完全一致的序列，各个地区虫株的差异性并未与所采集的地区产生相关性。

2.4 ITS-2 基因序列系统进化树构建 以山羊毛圆线虫（T.capricola）（GenBank序列号为JF276023）和短古柏线虫（C.curticei）（GenBank 序列号为AJ000033）作为系统发育分析的外群，利用MEGA 5.0 软件构建系统发育树（NJ 树），结果显示：本研究得到的15种类型的ITS-2序列与各国的捻转血矛线虫聚类形成一个小分支，且15种类型的序列不是按地区聚类，而是交叉分布。由此可见，本研究中来自山羊粪便的血矛属线虫均为捻转血矛线虫，且ITS-2 序列的变异与虫株的地理位置无相关性。

表1 捻转血矛线虫15个类型的ITS-2基因序列核苷酸变异位点

3 讨论

由于核糖体第二内转录间隔区（rDNA ITS-2）在生物进化过程中显示种的特征，种内具有高度保守性，而在不同种间又具有不同程度的变异，所以是较理想的种间鉴定遗传标记[8]。目前，ITS-2 作为分子分类标记已广泛应用于寄生虫的检测，如弓形虫[9-11]、隐孢子虫[12-13]和犬新孢子虫[14]等。目前，有关血矛线虫的分子鉴定主要以虫体为材料来进行，而非虫卵。因此，本研究对绵阳地区疑似血矛属线虫的虫卵进行了分子鉴定。

研究发现，测序所得60 条序列的ITS-2 和28 S基因片段的长度均为265 bp，其中ITS-2基因片段的长度为191～192 bp，该结果与Bott 等[7]报道的结果一致；且来自绵阳3 县的60 份样品的ITS-2基因片段与已报道的其他地理来源的捻转血矛线虫株的同源性达95.8%～100%。NJ 树揭示60条ITS-2序列归类的15种类型与源自美国、澳大利亚、法国等地的捻转血矛线虫聚为一大支系，且不同地理来源的虫株并未因地域关系而归为不同的分支，由此推测ITS-2 序列变异与虫株地理分布的相关性不明显。这一结果与严若峰[15]等报道的刚好相反，可能是由于各研究所使用的ITS-2片段大小不同所致，本研究仅用ITS-2部分片段作分析，而严若峰等使用的是ITS-2 全序列作分析。

4 结论

综上所述，绵阳地区60份山羊粪便中疑似血矛属虫卵的样品均为捻转血矛线虫（H.contortus），且ITS-2 序列在种内保守程度高，不同地域来源的分离株变异小。本研究为绵阳地区山羊捻转血矛线虫的分子分类和种群遗传分析奠定了一定的基础。