结缔组织生长因子PD98059和LY294002在调节大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖迁移中的作用

胡 煜, 周孟君, 李 刚, 刘 斌, 余 静

(1.四川省绵阳市中心医院儿科， 四川 绵阳 621000 2.西南医科大学附属医院儿科, 四川 泸州 646000)

先天性心脏病(CHD)是小儿常见心血管疾患，左向右分流型CHD多并发肺动脉高压(PAH)，若进展为Eisenmenger综合征则失去治疗机会。肺血管重构是梗阻性PAH的病理学特征，其中包括肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的生物学行为改变，如细胞外基质沉积。PASMC功能受多种细胞因子调控，研究发现肺动脉高压动物模型中结缔组织生长因子(CTGF)基因和蛋白表达明显增，且CTGF可促进PASMC胶原蛋白分泌，故推测CTGF与PASMC还有更广泛的联系。细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)和三磷酸肌醇激酶(PI3K/PKB)通路参与多种细胞的增殖迁移 ，故推测PASMC的增殖迁移也可能经这两条通路[1]。PD98059和LY294002分别为ERK1/2和PI3K通路阻断剂，本课题以大鼠PASMC为对象，研究上述两种阻断剂能否抑制CTGF刺激下的PASMC增殖迁移。

1 材料与方法

1.1PASMC培养和鉴定:6-8周龄SD大鼠，断颈处死后取肺动脉血管中层肌性组织，眼科剪将其分离为1-2mm3大小块状物后接种培养瓶(1～2块/cm2)，静置于37℃、5%CO2培养箱贴壁2h后取出培养瓶，缓慢加入M199培养基(含10%胎牛血清)继续培养7-10d可见细胞从组织块边缘长出，待其覆盖瓶底面积70-80%后传代至第3代做细胞爬片，免疫组化检测a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)阳性可鉴定为PASMC。将PASMC分为空白组、CTGF组、CP组(CTGF+PD98059)、CL组(CTGF+LY294002)、CPL组(CTGF+PD98059+LY294002)，分别加入含相应试剂的M199培养基(含10%胎牛血清)培养。(试剂浓度:CTGF:50ng/mL,PD98059:20μmoL/L,LY294002:10μmoL/L)

1.2方 法

1.2.1PASMC增殖检测:接种3-5代细胞于96孔板，每孔5×103个，贴壁过夜，弃原液后按分组加入培养基各100ul，分别培养24h、48h、72h、96h、120h后用WST-1细胞增殖检测试剂孵育4h后酶标仪测各孔吸光值(OD值)，每组5个复孔，绘制细胞生长曲线。

1.2.2PASMC迁移检测:Transwell接种细胞于Transwell(8um)小室，1×105个/室，放入24孔板内(事先按分组加入培养基各800ul)，37℃、5% CO2培养分别培养6h、12h后，棉球轻轻抹去小室滤膜上层细胞，甲醇固定滤膜5min，考马斯亮蓝染色15min，400倍光镜下计数上下左右中5个视野穿膜细胞，每组5个复孔。细胞划痕:将Culture Insert(培养插件)置于6孔板，于培养插件每孔中加入70ul细胞悬液(3×105个/mL)，37℃、5% CO2培养4h细胞贴壁后移除培养插件(每孔可见500um宽度划痕)，按分组加入培养基各3mL，继续培养12h、24h后观察划痕宽度，Wimasis软件分析实验图片。细胞骨架:将玻片置于6孔板，每孔接种细胞3×105个，37℃、5% CO2培养24h后细胞爬满玻片，弃原培养液，按分组加入干预试剂各3mL，继续培养12h、24h后取玻片甲醇固定5min，考马斯亮蓝染色15min，镜检观察细胞骨架。

1.3统计学处理:计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，组间均数比较用LSD-t法，用SPSS23.0统计学软件分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1PASMC培养和鉴定:显微镜下观察到细胞从组织块边缘长出(图1)，形态呈长梭形，细胞基质均匀分布，细胞核位于细胞中央，呈杆状或椭圆形，可多个核仁。细胞平行生长，细胞连接紧密，间隙小，因细胞稳定的增殖周期而使其呈“波谷状”生长方式排列(图2)，α-SMA免疫组化染色为鉴定金标准，如>95%细胞染色为阳性则为PASMC(图3)。

2.2细胞增殖:WST-1法测OD值描绘细胞增殖曲线。相比空白组，CTGF刺激PASMC24、48、72、96和120h后增殖水平升高(P均<0.05)；相比CTGF组，CP、CL和CPL组PASMC在干预24、48、72、96和120h后增殖水平有不同程度下降，其中CPL组下降最显著(P均<0.05)，见表1，图4。

2.3细胞迁移:各组Transwell小室均可观察到穿膜细胞，干预6h和12h后各组细胞计数的差异均有统计学意义(P<0.05)。相比空白组，CTGF组细胞穿膜数量增加(P<0.05)；相比CTGF组，CP、CL和CPL组细胞穿膜数量减少，CPL组减少最显著(P均<0.05)，见表2，图5。细胞划痕示干预12h和24h后各组划痕宽度计数的差异均有统计学意义(P<0.05)。相比空白组，CTGF组细胞划痕宽度减小(P<0.05)；相比CTGF组，CP、CL和CPL组细胞划痕宽度有不同程度增加，CPL组增加显著(P均<0.05)，见表3，图6。细胞骨架染色示干预12h后可见CTGF组细胞骨架模糊不清，其余各组清晰可见,且CP、CL和CPL组更加清晰；干预24h观察所见各组细胞骨架清晰度与12h无明显差异。见图7。

表1 WST-1检测OD值

注:1)与空白组比较，P<0.05；2)与CTGF组比较，P<0.05

表2 Transwell测PASMC透膜数

注:1)与空白组比较，P<0.05；2)与CTGF组比较，P<0.05

表3 Culture Insert测PASMC划痕宽度

注:1)与空白组比较，P<0.05；2)与CTGF组比较，P<0.05

图1 PASMC原代培养 ×100倍

图2 PASMC传代培养 ×200倍

图3 PASMC α-SMA免疫组化染色×200倍

图4 PASMC增殖趋势图

图5 Transwell检测细胞迁移(×400倍)

图6 细胞划痕检测细胞迁移(×100倍)

图7 考马斯亮蓝检测细胞骨架(×400倍)

3 讨 论

左向右分流型CHD常并发PAH和进行性右心衰竭，充血性PAH可导致肺组织结构改变包括肺血管收缩、重构和血栓形成而出现梗阻性PAH ，最终导致Eisenmenger综合征。肺血管重构是PAH的病理特征，在肺血管重构中存在血管内皮细胞、成纤维细胞和肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖迁移等现象，表现为肺小动脉中膜增厚、新生肺小血管形成和非肌性小动脉肌化等。PASMC常随新生肺小血管中成纤维细胞增殖而分裂，并在增殖迁移过程中伴随细胞外基质蛋白(如胶原蛋白、纤维连接蛋白等)沉积从而导致肺血管重构、肺组织纤维化及顺应性降低。

多种因素与PASMC增殖迁移有关，如低氧、PDGF、VEGF和CTGF等[2,3]。CTGF是富含半胱氨酸的分泌肽，由血管内皮细胞、成纤维细胞、神经细胞和平滑肌细胞合成分泌，它与心脏、血管、肾脏、肺及肝脏等组织器官纤维化发生发展密切相关。Bradley A等通过建立大鼠PAH模型，观察到肺小动脉有内膜胶原沉积并伴有内皮功能障碍，肺血管内PASMC增多，肺小动脉CTGF水平升高[4]。本实验发现，与对照组比较，CTGF刺激下的PASMC增殖速度增快，Transwell穿模细胞数目增加，细胞划痕融合速度加快并在24h内基本消失，细胞骨架模糊不清，说明细胞增殖迁移现象较显著。细胞增殖速度加快与细胞周期缩短有关，而细胞迁移则为增殖提供了空间，细胞迁移是细胞增殖、ECM和细胞骨架变化共同作用的结果。CTGF能增加PDGF-BB、TGF-β和IGF的作用，在体内PDGF-BB和IGF均可刺激细胞增殖。研究发现低氧状态下血管平滑肌细胞中CTGF表达增加并能提高的增殖和迁移率，而抗CTGF抗体可阻止这一现象。另有研究表明[5]，TGF-β诱导的细胞迁移可由CTGF可介导，TGF-β除直接影响心脏修复细胞外还可能通过诱导下游效应物的表达而发挥作用，如基质细胞蛋白CTGF或内皮素(ET-1),以上研究提示CTGF与PASMC增殖迁移有关。

CTGF是一种36～38 kDa的富含半胱氨酸的分泌蛋白，其促进细胞增殖迁移的机制尚不清楚，推测CTGF可能是某些整合素复合体的配体[6]。研究发现猫肾脏近端小管细胞的磷脂酸受体和Gαq蛋白可以Rho/Rho-激酶和αvβ6整合素依赖的方式激活潜在的TGF-β并促进PDGF-B和CTGF的产生和分泌，CTGF介导肝星状细胞基质沉积及肝纤维化过程中整合素αvβ1 siRNAs表达增加[6]，也可通过αvβ3整合素诱导少突胶质细胞前体细胞增殖，本课题前期研究发现整合素β1和β3信号途径能介导CTGF诱导的PASMC增殖迁移和细胞外基质基因的表达，故推测CTGF可能与细胞表面的整合素受体结合产生第二信使经信号转导通路启动下游基因表达，从而通过增加DNA合成、改变细胞周期和骨架蛋白合成等方式来促进细胞增殖迁移。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是真核生物信号传递网络中的重要途径，在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用。PD98059是非ATP竞争性丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂，能特异地抑制MEK-1-介导的MAPK活化，抑制细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化，并下调细胞周期蛋白E/Cdk2和D1/Cdk4水平，导致细胞阻断在G1期。三磷酸肌醇激酶(PI3K/PKB)通路是许多细胞因子的下游信号传导通路，通过调节细胞周期G2/M期抑制细胞凋亡，调控细胞RNA转录以及蛋白质合成，促进细胞增殖迁移和血管生成[7]。LY294002可以通透细胞，特异性抑制PI3K并抑制PI3K/Akt信号途径。本研究观察到PASMC在PD98059和/或LY294002干预下增殖速度较CTGF刺激组减慢，且抑制程度随着干预浓度增加，Transwell穿模细胞数减少，细胞划痕宽度减小速度变缓，细胞骨架解聚和重构的现象不明显，细胞骨架清晰。另有研究发现[8,9]，PD98059能抑制人皮肤成纤维细胞CTGF的表达，LY294002可通过抑制PI3K信号通路而减少肿瘤组织中血管内皮细胞CTGF蛋白表达，并可协同其他化疗药物抑制CTGF对肿瘤生长的促进作用。这些研究提示CTGF促进PASMC增殖迁移过程可能经过ERK1/2和PI3K/PKB信号通路。

本研究发现PAH肺血管重构因素复杂，CTGF可能通过刺激PASMC增殖迁移的方式加重肺血管重构。PASMC增殖迁移过程可被PD98059和/或LY294002抑制，提示它们所阻断的ERK1/2和PI3K通路可能参与了CTGF刺激下的PASMC增殖迁移，并可能是阻断或减轻肺血管重构的新靶点。