核因子κB 和胆固醇调节原件结合蛋白2 在原发性肝癌组织中的表达及与患者临床特征和预后的关系

张蓓，答秀维，张乐，兰飞

空军军医大学第二附属医院唐都医院1疼痛科，2肿瘤科，西安7100380

原发性肝癌是临床中常见的恶性肿瘤之一，发病率及病死率极高，严重威胁人类的生命健康。原发性肝癌的病因及发病机制尚未明确，目前认为其与病毒性肝炎、肝硬化、遗传等因素有关[1-3]。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是细胞内重要的转录因子，可在第一时间对有害细胞的刺激做出反应，调控基因转录[4-5]。胆固醇调节原件结合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2，SREBP2）是位于内质网膜上的二次跨膜蛋白，可促进机体代谢，调控胆固醇合成[6]。研究表明，NFκB、SREBP2 与多种肿瘤的生存、增殖、转移、黏附和侵袭密切相关[7]。本研究探讨了原发性肝癌组织中NF-κB 和SREBP2 的表达情况，并分析其与患者临床特征及预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2015 年1 月至2017 年1 月空军军医大学第二附属医院唐都医院收治的原发性肝癌患者。纳入标准：①经手术或穿刺活检病理确诊为原发性肝癌；②生存时间＞6 个月；③临床资料完整；④TNM 分期为Ⅰ～Ⅲ期。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②合并器官衰竭等严重疾病；③出现远处转移；④术前已进行化疗或放疗。依据纳入和排除标准，本研究共纳入74 例患者。74 例患者中，男42 例，女32 例；年龄31～72 岁，平均年龄（58.41±3.58）岁；肿瘤数目：单发62 例，多发12 例；病理类型：肝细胞癌50 例，其他24 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期50 例，Ⅲ期24 例。收集74 例原发性肝癌患者的原发性肝癌组织74 例和癌旁正常组织（距离肿瘤组织边缘＞3 cm）46 例。

1.2 免疫组织化学染色方法

采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（streptavidin-perosidase）法进行免疫组织化学染色。将肝癌组织和癌旁正常组织标本经常规石蜡切片、脱水后，加入100%、95%、85%梯度乙醇各5 min，自来水冲洗。将切片置于3%过氧化氢溶液-甲醇中，室温静置10 min，蒸馏水冲洗3 min，采用pH 9.0 的乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）缓冲液煮沸20 min 进行抗原修复，加入一抗（1∶70）室温放置2 h。显色剂显色，苏木精复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在显微镜下观察NF-κB、SREBP2 的表达情况，检测过程严格按照说明书进行。Elecsys2010 电化学发光分析仪及相关试剂均购自罗氏公司。

1.3 评分标准

由2 位高年资病理医师采用双盲法进行阅片。NF-κB、SREBP2 阳性颗粒位于细胞质或细胞核中，呈棕黄色或棕褐色[8]。染色强度评分：无色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 份，棕褐色为3分。阳性细胞百分比评分：＜26%为1 分，26%～50%为2 分，51%～75%为3 分，＞75%为4 分。染色强度评分与阳性细胞百分比评分相乘，0～1 分为阴性（-），2～4 分为弱阳性（+），5～8 分为中等阳性（++），9～12 分为强阳性（+++）。阳性表达率=阳性例数/总例数×100%。

1.4 随访

治疗结束后，以电话随访及门诊复诊的方式对74 例原发性肝癌患者进行2 年随访，详细记录两组患者治疗后的总生存时间（即患者开始治疗至随访截止或患者死亡的时间）。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，组间比较采用Log-rank 检验；采用Cox 回归模型进行多因素分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原发性肝癌组织和癌旁正常组织中NF-κB、SREBP2 表达情况的比较

原发性肝癌组织中NF-κB、SREBP2 的阳性表达率分别为71.62%（53/74）和68.92%（51/74），分别高于癌旁正常组织的50.00%（23/46）和47.83%（22/46），差异均有统计学意义（χ2=5.711，P=0.017；χ2=5.297，P=0.021）。

2.2 不同临床特征原发性肝癌患者原发性肝癌组织中NF-κB、SREBP2 表达情况的比较

不同性别、年龄、肿瘤直径的原发性肝癌患者原发性肝癌组织中NF-κB、SREBP2 的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。低分化、TNM 分期为Ⅲ期、有脉管侵犯、有淋巴结转移、病理类型为肝细胞癌的原发性肝癌患者原发性肝癌组织中NF-κB 的阳性表达率分别高于中/高分化、TNM 分期为Ⅰ～Ⅱ期、无脉管侵犯、无淋巴结转移、其他病理类型的患者，差异均有统计学意义（χ2=8.385、25.620、15.661、11.605、10.245，P＜0.05）。低分化、TNM 分期为Ⅲ期、有脉管侵犯、有淋巴结转移、病理类型为肝细胞癌的原发性肝癌患者原发性肝癌组织中SREBP2 的阳性表达率分别高于中/高分化、TNM 分期为Ⅰ～Ⅱ期、无脉管侵犯、无淋巴结转移、其他病理类型的患者，差异均有统计学意义（χ2=4.894、8.837、10.956、11.663、8.581，P ＜0.05）。（表1）

表1 不同临床特征原发性肝癌患者原发性肝癌组织中NF-κB、SREBP2 的表达情况

2.3 生存情况的比较

NF-κB 阴性表达和NF-κB 阳性表达患者的平均生存时间分别为（30.43±6.23）个月和（22.25±5.24）个月，SREBP2 阴性表达和SREBP2 阳性表达患者的平均生存时间分别为（30.17±7.34）个月和（22.37±5.81）个月。生存分析显示，NF-κB 阴性表达患者的生存情况优于NF-κB 阳性表达患者，差异有统计学意义（χ2=4.431，P=0.035）；SREBP2 阴性表达患者的生存情况优于SREBP2 阳性表达患者，差异有统计学意义（χ2=4.889，P=0.028）。（图1、图2）

2.4 原发性肝癌患者预后影响因素的单因素分析

图1 NF-κB阴性表达（n=21）和NF-κB阳性表达（n=53）原发性肝癌患者的生存曲线

图2 SREBP2阴性表达（n=23）和SREBP2阳性表达（n=51）原发性肝癌患者的生存曲线

不同性别、年龄、肿瘤直径原发性肝癌患者的2 年生存率比较，差异均无统计学意义（P ＞0.05）。NF-κB 阴性表达、SREBP2 阴性表达、中/高分化、TNM 分期为Ⅰ～Ⅱ期、无脉管侵犯、无淋巴结转移、病理类型为其他的原发性肝癌患者的2 年生存率分别高于NF-κB 阳性表达、SREBP2 阳性表达、低分化、TNM 分期为Ⅲ期、有脉管侵犯、有淋巴结转移、病理类型为肝细胞癌的原发性肝癌患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

2.5 原发性肝癌患者预后影响因素的多因素Cox回归分析

以单因素分析中差异有统计学意义的因素作为自变量，以患者预后作为因变量进行Cox 回归分析，结果显示，NF-κB 阳性、SREBP2 阳性、低分化、TNM 分期为Ⅲ期、有脉管侵犯、有淋巴结转移、病理类型为肝细胞癌均是原发性肝癌患者预后的独立危险因素（P＜0.05）。（表3）

2.6 NF-κB 与SREBP2 表达的关系

NF-κB 阴性原发性肝癌患者原发性肝癌组织中SREBP2 的阳性表达率为33.33%（7/21），明显低于NF-κB 阳性患者的83.02%（44/53），差异有统计学意义（χ2=17.334，P＜0.01）。（表4）

3 讨论

原发性肝癌具有侵袭性强、易复发、易转移等生物学特性，尽管现代诊疗技术不断发展，仍无法改变患者确诊时间晚、治疗后复发率高、远期疗效差的现状。越来越多的研究表明，NF-κB 和SREBP2 与肿瘤的发生具有密切关系[8-9]。研究报道，乳腺癌、胃癌、甲状腺癌、大肠癌中NF-κB 和SREBP2 均有阳性表达[10]。

表2 原发性肝癌患者预后影响因素的单因素分析（n=74）

表3 原发性肝癌患者预后影响因素的多因素Cox 回归分析（n=74）

表4 NF-κB 与SREBP2 表达的关系

NF-κB 是近年来发现的重要转录因子之一，广泛存在于哺乳动物中，可与B 淋巴细胞免疫球蛋白κ轻链基因的增强子κB 序列特异性结合。研究发现，活化的NF-κB 能够上调细胞间黏附因子的表达，参与肿瘤的发生、发展、侵袭及转移[11-12]。SREBP2 是一种调控胆固醇合成的关键限速酶，有学者发现，沉默SREBP2 可有效减少细胞内胆固醇的聚集[13]。本研究结果显示，原发性肝癌组织中NF-κB、SREBP2 的阳性表达率均高于癌旁正常组织（P＜0.05）；且NF-κB、SREBP2 阳性表达患者的2 年生存率分别低于NF-κB、SREBP2 阴性表达的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。说明NFκB 和SREBP2 在原发性肝癌患者中阳性表达，可能是作为癌基因参与原发性肝癌的发生、发展，这一研究结果与既往文献报道的结果一致[14]。

本研究结果显示，低分化、TNM 分期为Ⅲ期、有脉管侵犯、有淋巴结转移、病理类型为肝细胞癌的原发性肝癌患者原发性肝癌组织中NF-κB 和SREBP2 的阳性表达率分别高于中/高分化、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无脉管侵犯、无淋巴结转移、其他病理类型的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05），与李晓枫和刘展华[15]报道的结果一致。本研究分析了NF-κB、SREBP2 表达情况与原发性肝癌患者预后的关系，结果发现，NF-κB、SREBP2 阴性表达患者的生存情况分别优于NF-κB、SREBP2 阳性表达的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。提示NF-κB、SREBP2 与原发性肝癌患者的预后具有密切联系。分析其原因可能是细胞受到外源刺激后，活化的NF-κB 和SREBP2 进入细胞核内，发挥其功能。本研究的Cox 回归分析结果显示，NF-κB阳性、SREBP2 阳性、低分化、TNM 分期为Ⅲ期、有脉管侵犯、有淋巴结转移、病理类型为肝细胞癌均是原发性肝癌患者预后的独立危险因素（P＜0.05）。再次证实了NF-κB、SREBP2 在原发性肝癌发生、发展及预后评估中的价值。本研究结果还显示，NF-κB 阴性原发性肝癌患者原发性肝癌组织中SREBP2 的阳性表达率为33.33%（7/21），明显低于NF-κB 阳性患者的83.02%（44/53），差异有统计学 意 义（χ2=17.334，P ＜0.01）。提 示NF-κB 与SREBP2 的表达密切相关，表明SREBP2 可能通过NF-κB 的激活参与原发性肝癌的发生、发展，但其机制有待进一步研究。

综上所述，NF-κB 和SREBP2 在原发性肝癌组织中的阳性表达率较高，NF-κB 和SREBP2 阳性表达患者多合并脉管侵犯、低分化、高TNM 分期及淋巴结转移等特征，NF-κB 和SREBP2 阳性表达的原发性肝癌患者的预后较差。临床中检测NF-κB 和SREBP2 的表达情况对监测原发性肝癌患者病情、肿瘤转移及评估预后具有重要意义。