PBD和RSM联用优化聚酯型儿茶素A化学合成技术参数

张建勇，陈琳，崔宏春，王伟伟，薛金金，熊春华，江和源*

PBD和RSM联用优化聚酯型儿茶素A化学合成技术参数

张建勇1,2，陈琳2，崔宏春3，王伟伟2，薛金金2，熊春华1*，江和源2*

1. 浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 310018；2. 中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；3. 杭州市农业科学研究院茶叶研究所，浙江 杭州 310024

为探明化学合成条件对聚酯型儿茶素A（Theasinensin A，TSA）得率的影响，通过单因素试验和Plackett-Burman Design（PBD）确定TSA化学合成关键因子，然后采用响应面法（Response surface methodology，RSM），进一步优化TSA化学合成技术参数。结果表明，氯化铜用量、甲醇体积分数、温度对TSA得率的影响差异极显著，主因素效应为甲醇体积分数>氯化铜用量>温度，最优条件为氯化铜用量43%，甲醇体积分数26%，温度15℃，聚酯型儿茶素得率为59.12%，与模型预测值59.34%接近。PBD和RSM联用优化TSA化学合成工艺可行，预测性较好，可为其他种类儿茶素氧化聚合物的高效化学合成提供借鉴和理论依据。

TSA；EGCG；化学合成；PBD；RSM；优化

聚酯型儿茶素（Theasinensins）是红茶、黑茶、乌龙茶等发酵茶类中含量高于茶黄素（Theaflavins，TFs）的儿茶素二聚类氧化产物[1]，由Roberts E.A.H于1957年最先发现[2]，1959年Roberts E.A.H提出其结构式[3]，之后Nonaka等[4]、Hashimoto等[5]、Shii等[1]陆续分离鉴定出8种聚酯型儿茶素单体，分别是Theasinensin A（TSA）、Theasinensin B、Theasinensin C、Theasinensin D、Theasinensin E、Theasinensin F、Theasinensin G、Theasinensin H，其中TSA因其含量显著高于其他聚酯型儿茶素类物质，受到国内外学者广泛关注。聚酯型儿茶素具有多种生物活性，在抗氧化[6-10]、防癌抗癌[11-13]、抗炎[14-19]、降脂减肥[20-23]、降胆固醇[24]、降血糖[25]、保肝[26-27]等方面活性高于部分茶叶儿茶素和茶黄素，是近年来茶叶化学研究领域的研究热点之一。但是，由于聚酯型儿茶素不易从茶叶中大量提取制备，无法满足后续功能活性、作用机理、风味化学等研究的需要。

聚酯型儿茶素的体外合成途径主要包括酶促合成和化学合成。酶促合成具有高效性、专一性、温和性的特点，受到国内外学者广泛关注。Tanaka等[28-29]、Matsuo等[30]、Li等[31]、薛金金[32]、徐斌等[33]、施莉婷等[34]采用茶叶、梨等不同来源多酚氧化酶氧化EGCG，初步明确聚酯型儿茶素酶促合成机理，即EGCG氧化形成邻醌EGCGQ，邻醌进一步形成DTSA（脱氢聚酯型儿茶素A），DTSA通过氧化还原歧化反应形成TSA。尽管酶促合成可以得到TSA，但是由于多酚氧化酶专一性催化形成TSA效率不高、酶促氧化体系底物竞争关系复杂等原因，酶促合成法制备的TSA得率不高，目前已报道的得率均低于30%[28-30]。经典化学合成理论显示，相对于酶促合成，化学合成法副产物更多，不易得到高含量和高得率的产物。但是，Takuya等[35]研究发现，采用氯化铜催化的化学合成法，其聚酯型儿茶素得率显著高于酶促合成法，为聚酯型儿茶素高效合成提供了一项新策略。由此可见，与酶促合成相比，虽然化学合成法底物竞争关系复杂，但是通过控制化学合成条件，仍然可以提高目标产物得率。然而，目前催化剂用量、溶剂含量、温度、催化时间等化学合成关键因子对TSA得率和底物当量变化的影响尚不明晰。

近年来，Plackett-Burman Design（PBD）和响应面分析法（Response surface Methodology，RSM）在茶叶化学成分提制方面研究方兴未艾。赵熙等[36]在单因素试验基础上，采用Plackett-Burman和Box-Behnken设计，对绿茶总黄酮工艺进行响应面优化，确定总黄酮最佳提取条件为乙醇质量分数77%、液固比42∶1、提取次数2次，提取率为3.76%，与模型预测值3.79%基本相符。Liu等[37]采用响应面法，分析了浸出条件对绿茶茶汤的化学成分浸出、感官特性和抗氧化活性的影响，得出最优浸出条件为冲泡温度82℃、冲泡时间5.7 min、茶水比70 mL·g-1、粒度1 100 μm。Guo等[38]在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken设计和响应面法优化茶叶中茶多酚和茶多糖同步提取条件，得出最佳提取条件为温度99℃、提取时间175 min、液料比46 mL·g-1。由此可见，尽管PBD、RSM在茶叶总黄酮、茶多酚、茶多糖提取方面得到了应用，但是针对TSA化学合成技术参数优化的研究鲜有报道。

本文从不同因子条件下底物和目标产物当量变化规律角度出发，解析化学合成法TSA得率较高的原因，并采用PBD和RSM联用法，研究温度、催化时间、氯化铜用量、溶剂体积分数等关键因子对TSA形成的影响，获得最佳TSA化学合成技术参数，以期为TSA的批量高效合成制备提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和材料

Epigallocatechin gallate（EGCG）购于无锡太阳绿宝科技有限公司（纯度≥98.0%）；TSA单体由日本Tanaka教授友情提供；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）购自德国Merck公司；氯化铜、抗坏血酸、甲醇、磷酸等试剂均为国产分析纯；大孔吸附树脂HP20购于北京华威锐科化工有限公司。

Waters 2695-600-717 HPLC（美国Waters公司），HH-W420S恒温水浴锅（上海精科实业有限公司）、MR3001磁力搅拌器（Heidoph公司），R-124旋转蒸发仪（瑞典BUCHI公司），5810R离心机（德国Eppendorf公司），KQ-300DE数控超声波清洗器（中国昆山市超声仪器有限公司），LGJ-50真空冷冻干燥机（中国北京四环科学仪器厂有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 TSA化学合成

称取1 mmol的EGCG于500 mL三角锥瓶中，加入甲醇溶液充分溶解，加入氯化铜催化，摇匀至完全溶解，1 000 r·min-1磁力搅拌反应24 h后，加入过量抗坏血酸，5 000 r·min-1离心10 min，取上清液，大孔吸附树脂HP20分离，洗脱剂为80%甲醇溶液，将富集TSA的组分浓缩，真空冷冻干燥得TSA，HPLC检测。

TSA得率=TSA质量÷EGCG用量×100%

1.2.2 TSA化学合成条件的单因素试验和工艺优化

氯化铜用量对TSA得率的影响：氯化铜用量分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%（氯化铜用量=氯化铜质量÷EGCG质量×100%，下同），EGCG为1 mmol，溶剂体系为30%甲醇溶液，温度为20℃，催化时间为24 h。

甲醇体积分数对TSA得率的影响：溶剂体系分别为纯水（0%甲醇）、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇，氯化铜用量为40%，EGCG为1 mmol，温度为20℃，催化时间为24 h。

温度对TSA得率的影响：设置温度分别为–10℃、0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃，溶剂体系为30%甲醇，氯化铜用量为40%，EGCG为1 mmol，催化时间为24 h。

催化时间对TSA得率的影响：设置催化时间分别为6、12、18、24、28、32 h，溶剂体系为30%甲醇，氯化铜用量为40%，EGCG为1 mmol，温度为20℃。

TSA化学合成技术参数优化：在单因素试验的基础上，通过PBD统计分析（因素水平设计见表1和表2），筛选出对TSA得率具有显著影响的因子，然后采用RSM方法（因素水平设计见表3），建立TSA得率回归方程，通过响应面优化法，优化TSA化学合成技术参数。

1.2.3 HPLC分析条件

色谱柱：日本cosmosil 5C18-AR-Ⅱ柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）。流动相：A相为50 mmol·L-1磷酸，B相为100%乙腈。洗脱梯度：0~39 min，B相由4%线性升至30%；39~54 min，B相由30%线性升至75%；54~55 min，B相由75%线性降至4%。进样量10 µL，流速为0.8 mL·min-1，柱温为35℃，检测波长为280 nm。

1.2.4 数据处理

采用Minitab 19.0进行数据处理和统计分析，统计分析方法包括差异显著性分析、主因素效应分析、方差分析、回归分析。

2 结果与分析

2.1 TSA化学合成单因素试验结果

2.1.1 氯化铜用量对TSA化学合成的影响

由图1可知，随着氯化铜用量的增加，TSA得率呈现出先增加后减少的趋势，当氯化铜用量为40%时，聚酯型儿茶素得率达到最大值59.00%，且与20%、30%、50%、60%、70%氯化铜用量条件下的TSA得率均达到差异显著水平；氯化铜用量在50%、60%、70%条件下，TSA得率低于59.00%，且差异不显著，故确定氯化铜用量为40%。

比较不同氯化铜用量对底物原料EGCG消耗率影响可以看出，氯化铜用量小于50%时，EGCG消耗率不断提高，差异显著；氯化铜用量大于50%时，EGCG消耗率不再增加，且差异不显著，其原因可能是，虽然氯化铜用量40%条件下TSA得率相对较高，但是EGCG除了形成TSA之外，还可能形成其他氧化聚合副产物[1,21]，导致其在氯化铜用量50%时消耗率才达到最大。

2.1.2 甲醇体积分数对TSA化学合成的影响

由图2知，聚酯型儿茶素得率先随甲醇体积分数的增加而提高，但当甲醇体积分数达到30%时，随着甲醇体积分数继续增加TSA得率逐渐下降，且差异呈显著水平，原因可能是甲醇体积分数小于30%，EGCG化学合成主要向目标物TSA转化，但是超过30%时，化学合成副反应增多，TSA可能发生异构或降解作用[24]，从而导致其得率急剧下降。因此，确定甲醇体积分数为30%。

比较甲醇体积分数对EGCG消耗率影响可以看出，EGCG消耗率随甲醇体积分数的增加而逐渐提高，且差异呈显著水平；当甲醇体积分数达到30%以后，EGCG消耗率不再增加，其原因可能是，在甲醇/水的反应溶剂体系中，EGCG持续消耗，在甲醇体积分数为30%时EGCG当量不再发生变化。

2.1.3 反应体系温度对TSA化学合成的影响

由图3可知，TSA得率先随反应体系温度的升高而提高，但当温度达到20℃时，随着温度继续升高TSA得率迅速下降，且差异呈显著水平，原因可能是，温度过高条件下，底物EGCG可能发生降解，导致TSA形成量减少，且温度过高易诱发聚酯型儿茶素发生降解或异构化，进一步加剧TSA得率的下降[28]。因此，确定反应体系温度为20℃。

比较温度对EGCG消耗率影响可以看出，EGCG消耗率随温度的升高而逐渐提高，且在0~20℃差异显著；当温度达到20℃之后，EGCG消耗率不再增加，其原因可能是，EGCG随温度升高持续消耗，在温度达到20℃时EGCG当量不再发生变化。

2.1.4 催化时间对TSA化学合成的影响

由图4可知，TSA得率随催化时间的增加而逐渐提高，且在6~24 h时差异显著，但当催化时间达到24 h后，TSA得率虽然略有增加，但无显著差异。因此，确定催化时间为24 h。

注：字母a—d表示差异显著性，显著水平P<0.05

注：字母a—f表示差异显著性，显著水平P<0.05

注：字母a—d表示差异显著性，显著水平P<0.05

比较催化时间对EGCG消耗率影响可以看出，EGCG消耗率随催化时间增加而逐渐提高，差异显著；当催化时间达到28 h后，EGCG消耗率虽略有增加，但无显著差异。

2.2 PBD确定TSA化学合成关键影响因子

根据单因素试验结果，选择氯化铜用量、甲醇体积分数、温度、催化时间为考察因素，每个因素设置2个水平，试验次数为12次，每个试验号重复3次，以TSA得率为评价指标，因素水平编码及响应值见表1，采用MINITAB 19.0软件进行统计分析，比较各因素的T值和重要性。

显著性及方差分析结果见表2，影响TSA得率的因素重要性排序为：甲醇体积分数>氯化铜用量>温度>催化时间。值小于0.05表示考察因素有显著影响，值小于0.01表示考察因素有极显著影响。由表2方差分析结果可知，甲醇体积分数、氯化铜用量和温度对TSA得率的影响达到极显著水平，催化时间则影响不显著。采用MINITAB 19.0软件对各因素标准化主效应分析，结果见图5，对TSA得率影响强弱的顺序为：甲醇体积分数>氯化铜用量>温度>催化时间，催化时间对TSA得率的影响强弱差异不显著，可以根据效应正负和节本增效原则，将其控制在较好水平。综上，选择甲醇体积分数、氯化铜用量、温度作为TSA化学合成的关键影响因子，进行后续的RSM分析。

注：字母a—e表示差异显著性，显著水平P<0.05

表1 基于TSA化学合成技术参数的PBD因素设置及结果

表2 基于TSA化学合成技术参数的PBD因素效应分析

2.3 RSM优化TSA化学合成技术参数

2.3.1 化学合成技术参数模型的建立与统计分析

在PBD筛选试验的基础上，选择氯化铜用量（）、甲醇体积分数（）、温度（）进行优化试验。采用MINITAB 19.0软件进行Box-Behnken设计，因素水平编码见表3，试验设计及TSA得率响应值见表4。建立TSA得率（）与甲醇体积分数（）、氯化铜用量（）、温度（）的数学模型，回归方程为：

＝58.250＋2.998－1.291－3.311－4.7342－1.7912－6.0062＋0.485×＋0.895×－0.077B×

模型方差分析结果见表5，模型的总回归值<0.000 1（<0.01）达极显著水平，失拟项值=0.199 0（>0.05）呈不显著水平，说明该回归模型效应极显著且失拟度好，试验设计合理可靠。未调整前的相关系数2=0.994 4，经过试验优化，调整后的相关系数2adj=0.984 4，说明该回归模型可解释98.44%的可变性，预测值与真实值相关性好，试验误差小。另外，该回归模型的变异系数CV为4.19%，小于5%，说明该模型方程能较好反映真实的实验值，因此可以用该模型分析和预测不同化学合成条件下TSA得率的变化。

回归方程是经无量纲线性代码处理后所得，各回归系数已经标准化处理，因此可以通过直接比较其绝对值的大小来判断各因子的重要性[36-37]。比较回归方程的线性项>>，说明温度对TSA得率的影响最大，其次为氯化铜用量、甲醇体积分数。

图5 PBD标准化效应帕累托图

表3 基于TSA化学合成技术参数的RSM因素水平表

表4 基于TSA化学合成技术参数的RSM设计方案与结果

表5 TSA得率回归方程的方差分析表

注：*代表显著水平<0.05；**代表极显著水平<0.01

Note: * represents significant level<0.05. ** represents extremely significant level<0.01

2.3.2化学合成技术参数交互作用响应面分析

响应面图是TSA得率对化学合成技术因素的三维空间曲面图，根据TSA得率回归模型，采用MINITAB 19.0软件绘制响应面分析图，结果见图6。甲醇体积分数和温度的交互作用对TSA得率的影响最显著，响应面图中表现为响应面曲面较陡（图6-C）；而氯化铜用量和温度的交互作用（图6-B）、氯化铜用量和甲醇体积分数（图6-A）的交互作用次之，响应面图中表现为响应面曲面较平滑。

2.3.3 化学合成技术参数单因素效应分析

对TSA得率回归模型进行降维分析，考察其中一个因素时，将其他因素固定在0水平，得到单因素效应方程如下：

1＝58.250＋2.998－4.7342，对称轴=0.273；

2＝58.250－1.291－1.7912，对称轴=–0.313；

3＝58.250－3.311－6.0062，对称轴=–0.253

单因素效应方程可以描述各因素变化对值的影响。从图7单因素效应曲线图可以看出，TSA得率随着氯化铜用量的增加，呈现出先增加后减少的趋势，在编码值=0.286（对应氯化铜用量为41.23%）时，TSA得率达到最大值56.85%；聚酯型儿茶素的浸出率随着甲醇体积分数增大，呈先增加后减少的趋势，在编码值=–0.313（对应的甲醇体积分数为28.56%）时，达到最大值57.56%；聚酯型儿茶素的浸出率随着温度的升高，呈先增加后减少的趋势，在编码值=–0.253（对应的温度为14.12℃）时，达到最大值57.56%。单因素效应分析结果与单因素试验结果一致。

图6 两因素交互作用对TSA得率影响的响应面图

图7 单因素效应曲线

2.3.4 TSA化学合成技术参数模拟优化与验证

通过Minitab 19.0软件对回归模型进行优化，得到TSA化学合成最佳技术参数为：氯化铜用量42.92%，甲醇体积分数26.46%，温度14.94℃，聚酯型儿茶素得率理论最大值为59.34%。考虑到实际操作，将上述优化得到的最佳技术参数调整为氯化铜用量43%，甲醇体积分数26%，温度15℃，催化时间24 h。

为检验PBD和RSM联用法优化聚酯型儿茶素的可靠性，试验采用上述最优技术参数化学合成TSA，TSA得率为59.12%，与模型理论预测值接近，相对偏差为0.37%，说明该回归模型能够准确描述TSA得率与各技术参数之间的关系，符合统计学规律，得到的优化合成技术参数准确可靠，具有应用价值。

3 讨论与结论

Plackett-Burman Design（PBD）是以一种针对较多因子的筛选试验设计方法，首先在单因素试验基础上确定每个因子两水平，然后比较各因子两水平的差异与整体的差异来确定因子的显著性，从而达到筛选重要因子的目的[36]。响应面分析法，即响应曲面设计方法，是利用合理的试验设计方法并通过试验得到一定数据，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法，可以有效解决传统数理统计方法无法考虑各因素综合作用、无法给出响应值最优值的问题[37-38]。本研究首先采用单因素试验和Plackett-Burman Design（PBD），优选出氯化铜用量、甲醇体积分数、温度等TSA化学合成关键因子和合理水平，避免了非重要因子带来的时间和试验资源的浪费，然后采用RSM对聚酯型儿茶素化学合成技术参数进行优化，获得聚酯型儿茶素化学合成最佳条件，即氯化铜用量43%，甲醇体积分数26%，温度15℃，聚酯型儿茶素得率为59.12%，与模型预测值59.34%接近，可为其他种类儿茶素氧化聚合物的高效化学合成制备提供借鉴和理论依据。

酪氨酸酶、儿茶酚酶催化合成儿茶素氧化聚合物的共同特点是酶结构域包含铜离子活性中心，该活性中心催化儿茶素的O-双酚分子结构形成相应的O-邻醌分子结构，邻醌进一步缩合，形成不同聚合度的儿茶素氧化聚合物，包括聚酯型儿茶素、茶黄素等。由此可见，铜离子在聚酯型儿茶素、茶黄素等合成过程中起着重要的催化作用。Takuya等[35]比较了不同种类铜盐对聚酯型儿茶素化学合成的影响，发现氯化铜较其他铜盐具有更高的催化效率，但未对不同氯化铜用量、甲醇体积分数、温度、催化时间等对TSA得率的影响进行系统研究。本研究验证了氯化铜化学合成聚酯型儿茶素得率高于酶促合成法的结论，并在此基础上，系统分析了化学合成关键技术参数对TSA形成和底物消耗量的影响，得出了优化工艺技术参数。通过与经典多酚氧化酶酶促合成工艺的TSA得率相比，本研究优化后的化学合成工艺TSA得率提高了23%。酪氨酸酶、儿茶酚酶和氯化铜都含有铜，但是二者的催化效率却存在如此大的差异，这可能与大分子酶蛋白和小分子铜盐的铜离子靶向催化位点、不同分子结构域铜离子与底物结合能力、底物选择性合成等因素有关，深入的催化差异机理有待进一步研究。

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Optimization of Technical Parameters for Chemical Synthesis of Theasinensin A by PBD and RSM

ZHANG Jianyong1,2, CHEN Lin2, CUI Hongchun3, WANG Weiwei2, XUE Jinjin2, XIONG Chunhua1*, JIANG Heyuan2*

1. School of Food Science and biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China; 2. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 3. Tea Research Institute, Hangzhou Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310024, China

The effect of chemical synthesis conditions on the yield of theasinensin A was studied. Key factors for chemical synthesis of theasinensin A (TSA) were determined by single factor test and Plackett-Burman Design (PBD). The response surface methodology (RSM) wasemployed to optimize the technical parameters for the chemical synthesis. The experiment results indicate that the effects of copper oxide content, methanol content and temperature on the yield were extremely significant. The main factors were methanol content, next copper oxide content, and then temperature. The optimal conditions were as follows: copper chloride content 43%, methanol content 26%, and temperature 15℃. Under these conditions, the yield of TSA was 59.12%, which was close to the predicted value of 59.34%. The combination of PBD and RSM to optimize the chemical synthesis of TSA achieved ideal result, which could provide reference and theoretical basis for the efficient chemical synthesis of other catechin oxidation polymers.

theasinensin A (TSA), EGCG, chemical synthesis, PBD, RSM, optimization

Q946.84+1

A

1000-369X(2020)01-051-12

2019-11-04

2019-12-22

国家自然科学基金（31670692）、浙江省自然科学基金（LY18C160004）、公益性行业专项（201503142-11）、国家茶叶产业技术体系（CARS-23-03A）

张建勇，男，助理研究员，博士在读，主要从事茶叶化学与加工方面的研究。

xiongch@163.com，jianghy@tricaas.com