气相色谱-质谱法测定绿茶中草甘膦和氨甲基膦酸残留量

杨亚琴，冯书惠，胡永建，李圆圆，王会锋，刘进玺，钟红舰

气相色谱-质谱法测定绿茶中草甘膦和氨甲基膦酸残留量

杨亚琴，冯书惠，胡永建，李圆圆，王会锋，刘进玺，钟红舰*

河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（郑州），河南 郑州 450002

采用气相色谱-质谱联用建立了一种检测绿茶中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸残留量的测定方法。绿茶样品用水提取，经二氯甲烷液液分配和阳离子交换/反相吸附复合固相萃取柱净化，与三氟乙酸酐和七氟丁醇进行衍生化反应后，由气相色谱-质谱联用仪进行检测。该方法草甘膦定量限为0.05 mg·kg-1，在2~100 ng·mL-1浓度范围内呈现良好线性（R=0.999 3），氨甲基膦酸的定量限为0.02 mg·kg-1，在1~100 ng·mL-1浓度范围内呈现良好线性（R=0.999 2）。绿茶样品草甘膦添加浓度为0.25 mg·kg-1和0.50 mg·kg-1时，其平均回收率分别为90.8%和93.2%，相对标准偏差分别为4.93%和6.74%，氨甲基膦酸添加浓度为0.10 mg·kg-1和0.20 mg·kg-1时，其平均回收率分别为85.8%和95.4%，相对标准偏差分别为10.5%和5.16%。该方法净化效果好，杂质干扰小，回收率高，可满足绿茶中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的残留检测要求。

气相色谱-质谱法；草甘膦；氨甲基膦酸；绿茶

草甘膦（Glyphosate，PMG）作为一种广谱、非选择性、无残留、苗后传导性除草剂，因其价格低廉、除草性优良，被广泛应用于农田、果园、茶园等。1996年以来，随着大豆、玉米和油菜等抗草甘膦转基因作物的问世和推广应用，草甘膦的使用出现了迅猛增长[1]。虽然草甘膦毒性较低，但长期使用会影响土壤正常微生物的繁殖，是潜在的环境生态危险源。而且，草甘膦能够在环境和生物体中富集，最终通过食物链进入人体，对身体健康造成危害[2]。中国是世界上茶叶种植面积和产量最大的国家，茶叶作为我国文化传承的特色经济作物，具有较高的社会价值和较广的消费市场。近年来，有关茶叶中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸（Aminomethyl phosphonic acid，AMPA）残留量超标的报道时有发生。我国食品安全国家标准GB 2763—2016中，明确规定了茶叶中草甘膦最大残留限量为1 mg·kg-1[3]。

由于草甘膦和氨甲基膦酸均呈弱酸性，极性较强，易溶于水，难溶于有机溶剂，且挥发性低，难以气化，缺少生色基团，对其残留量分析的难度比较大。文献报道的草甘膦常用检测方法有分光光度法[4]、高效液相色谱法[5]、气相色谱法[6]、离子色谱法[7]、气相色谱-串联质谱法[8]、高效液相色谱-串联质谱法[9]、毛细管电泳法[10]、电化学分析法[11]等。国内对于茶叶样品中草甘膦残留量的检测方法则多为高效液相色谱-串联质谱法[9,12-15]，主要采用柱前衍生使草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸与氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC-Cl）反应形成荧光衍生物以增加极性被分析物的色谱保留。

气相色谱-质谱联用仪对草甘膦分析具有较大的优势，草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸通过与三氟乙酸酐-七氟丁醇等衍生试剂反应后，可生成易挥发物质用于气相色谱分析。毛细管色谱柱良好的分离能力结合质谱的高灵敏度、强选择性等特点，使得气相色谱-质谱联用法成为测定草甘膦残留量的有效方法之一。我国于2009年发布了植物性产品中草甘膦残留量测定的国家标准（GB/T 23750—2009）[16]，然而气相色谱-质谱法测定茶叶中草甘膦残留量却鲜有报道。本文针对茶叶样品基质复杂的特点，拟采用纯水提取绿茶中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸，经二氯甲烷液液分配和阳离子交换/反相吸附复合固相萃取柱净化，三氟乙酸酐-七氟丁醇衍生化反应后，通过气相色谱-质谱联用仪进行定性定量分析。该方法操作便捷、杂质干扰小、回收率和灵敏度均可达到农药残留分析要求，易于在茶叶分析检测实验室中推广应用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Shimadzu GCMS-QP2010 Plus型气相色谱-质谱联用仪（日本岛津公司）；LabTech EG20A plus型微控数显电热板（北京莱伯泰科仪器股份有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；飞鸽GL-21B型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；SK-1快速混匀器（金坛市白塔新宝仪器厂）。

草甘膦、氨甲基膦酸标准品，德国Dr. Ehrenstorfer公司；二氯甲烷：色谱纯，上海麦克林生化科技有限公司；乙酸乙酯、甲醇：色谱纯，德国默克股份两合公司；三氟乙酸酐：分析纯，北京百灵威科技有限公司（–20℃低温储存）；七氟丁醇：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司（–20℃低温储存）；浓盐酸（12 mol·L-1），烟台市双双化工有限公司；柠檬醛：分析纯，阿法埃莎（中国）化学有限公司；试验用水为Milli-Q超纯水。

PCX固相萃取小柱（150 mg/3 mL）、HLB固相萃取小柱（150 mg/3 mL），河北津杨滤材有限公司；茶叶样品均购于市场。

1.2 样品前处理

提取：称取2 g绿茶样品，放入50 mL具塞塑料离心管中，加入20 mL水，涡旋混匀1 min，浸泡过夜，室温下超声提取10 min，5 000 r·min-1离心5 min，将上层清液转移至另一离心管，加入50 μL浓盐酸，混匀后加入5 mL二氯甲烷，涡旋2 min，5 000 r·min-1离心5 min，弃去下层二氯甲烷相，取上层清液待过柱。

净化：PCX/HLB复合固相萃取小柱经3 mL甲醇、3 mL水活化后，缓慢加入5 mL上述提取液，收集流出液于50 mL烧杯中，再用3 mL水淋洗复合固相萃取小柱，合并流出液，于电热板上50℃蒸干。准确加入1 mL酸化甲醇水溶液（160 mL水、2.7 mL浓盐酸、40 mL甲醇混合液）于烧杯中，超声复溶后，通过0.45 μm有机滤膜，收集该净化提取液于小瓶中待衍生。

衍生化：取1.6 mL衍生试剂（三氟乙酸酐∶七氟丁醇=2∶1）于4 mL衍生小瓶，用移液器在衍生试剂液面下缓慢加入50 μL净化提取液，加盖混匀后立即放入冰水浴中冷却，然后于90℃条件下衍生反应60 min，期间每隔15 min充分摇匀1次。

衍生反应结束后，取出衍生小瓶，用氮气吹干，准确加入500 μL 0.2%柠檬醛乙酸乙酯溶液，加盖超声1 min，涡匀转移至上机小瓶中待测定。

1.3 气相色谱-质谱条件

色谱柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气：氦气（纯度≥99.999%），流速1.0 mL·min-1；升温程序：80℃保持1.5 min，以30℃·min-1升至260℃保持2 min，再以30℃·min-1升至300℃保持2 min；进样口温度：200℃；进样方式：无分流进样；电离方式：EI，70 eV；进样量：1 μL；接口温度：270℃；离子源温度：250℃；溶剂延迟：4 min；测定方式：选择离子监测法（SIM）。草甘膦和氨甲基膦酸衍生化产物的质谱采集信息见表1。

以上机液浓度50 ng·mL-1为例，根据上述仪器条件，所得草甘膦和氨甲基膦酸标准溶液衍生化产物的监测离子总离子流色谱图峰型对称，保留时间适宜，相较于草甘膦，氨甲基膦酸衍生化产物的色谱峰强度明显较高（图1）。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件优化

草甘膦和氨甲基膦酸均为强极性化合物，通常采用纯水进行提取[6,15-17]。由于绿茶样品富含蛋白质、色素、氨基酸、多酚类等杂质，所得纯水提取液成分复杂。为有效去除基质中杂质干扰，本文采用向纯水提取液中加入盐酸沉淀蛋白后，用二氯甲烷去除提取液中脂溶性杂质。对比文献及标准方法中提及的CAX阳离子交换柱，选用PCX/HLB复合固相萃取小柱可更好地去除样品中色素等杂质干扰，且直接收集净化流出液可以有效避免常规方法[16]选用洗脱液进行淋洗时目标化合物随杂质共同流出造成的回收率偏低。

表1 草甘膦和氨甲基膦酸衍生化产物的保留时间及监测离子信息

注：*：定量离子

Note: *: quantitative ions

在衍生化反应条件方面，采用正交试验对衍生过程中的3个因素，即因素A（三氟乙酸酐∶七氟丁醇）、因素B（衍生反应温度）、因素C（衍生反应时间）进行优化（表2）。待衍生溶液为草甘膦和氨甲基膦酸的混合标准溶液，衍生后所对应草甘膦、氨甲基膦酸的上机液浓度分别为50 ng·mL-1、20 ng·mL-1。衍生条件正交试验设计方案与试验结果见表3。

以相同水平对应定量离子峰面积之和Ki的极差R来分别评价不同因素对草甘膦、氨甲基膦酸衍生反应的影响。结果显示，根据极差R大小，各因素对草甘膦衍生反应的影响作用由大到小为A>C>B，最佳衍生条件为A3B3C2；各因素对氨甲基膦酸衍生反应的影响作用由大到小为A>B>C，最佳衍生条件为A3B2C3。综合考虑草甘膦和氨甲基膦酸的衍生反应效果，本文最终选择衍生条件A3B2C2，即三氟乙酸酐∶七氟丁醇=2∶1，反应温度90℃，反应时间60 min为最佳衍生条件。

2.2 线性方程和检出限

将草甘膦和氨甲基膦酸用空白绿茶基质液逐级稀释配制成质量浓度为1.00、0.40、0.20、0.10、0.04、0.02、0.01 μg·mL-1的混合标准溶液，按照本文1.2章节进行衍生，所得衍生化产物上机液质量浓度分别为100、40、20、10、4、2、1 ng·mL-1。以上机液浓度为横坐标（x，ng·mL-1），定量离子峰面积为纵坐标建立基质标准曲线（图2）。结果表明，在2~100 ng·mL-1浓度范围内，草甘膦衍生化产物呈良好线性，其线性方程=11.953-15.781，相关系数R=0.999 3；在1~100 ng·mL-1质量浓度范围内，氨甲基膦酸衍生化产物呈良好线性，其线性方程=102.35+17.189，相关系数R=0.999 2。

采用向空白绿茶样品中逐级降低加标液浓度的方法来确定检出限（LOD）和定量限（LOQ）。以3倍信噪比（S/N=3）对应的目标物浓度作为检出限，以10倍信噪比（S/N=10）对应的目标物浓度作为定量限，则氨甲基膦酸的方法检出限为0.008 mg·kg-1，定量限为0.02 mg·kg-1；草甘膦的方法检出限为0.02 mg·kg-1，定量限为0.05 mg·kg-1。

注：AMPA为氨甲基膦酸，PMG为草甘膦。下同

表2 衍生条件正交试验因素水平表

注：Ki表示相同水平对应定量离子峰面积之和，其中i代表1、2、3等3个水平；R表示同一因素下不同水平Ki的极差

Note: Ki: the sum of corresponding quantitative ion peak areas at the same level (i=1, 2, 3). R: the difference between the maximum and minimum values of Kiat three different levels under each factor

图2 草甘膦和氨甲基膦酸衍生化产物的绿茶基质标准曲线

2.3 方法精密度与回收率

选取6个草甘膦、氨甲基膦酸添加浓度分别为1.00 mg·kg-1和0.40 mg·kg-1的空白绿茶加标样品，按照1.2章节进行样品前处理，所得草甘膦、氨甲基膦酸的上机液浓度分别为50 ng·mL-1和20 ng·mL-1。气相色谱-质谱联用仪测得6个绿茶添加样品草甘膦衍生化产物的定量离子峰面积分别为454、430、482、508、480、456，其相对标准偏差RSD为5.83%；氨甲基膦酸衍生化产物的定量离子峰面积分别为1 818、1 979、1 802、1 949、1 904、1 885，其相对标准偏差RSD为3.71%，表明方法具有较好的精密度。

选取空白绿茶样品，在方法线性范围内对绿茶样品进行添加回收试验。草甘膦添加浓度分别为0.25 mg·kg-1和0.50 mg·kg-1，氨甲基膦酸添加浓度分别为0.10 mg·kg-1和0.20 mg·kg-1，其平均回收率范围为85.8%~95.4%，相对标准偏差为4.93%~10.5%（表4），表明方法的准确度较好。图3为空白绿茶样品中添加浓度为0.25 mg·kg-1草甘膦和0.10 mg·kg-1氨甲基膦酸衍生化产物的监测离子色谱图。

表4 草甘膦和氨甲基膦酸绿茶样品中的回收率和相对标准偏差（n=4）

图3 添加草甘膦（0.25 mg·kg-1）和氨甲基膦酸（0.10 mg·kg-1）绿茶样品衍生化产物的监测离子色谱图

2.4 实际样品检测

应用本文所建立的方法对市场购买的51个绿茶样品进行测定。结果显示，有16个样品检出草甘膦，其含量范围在0.085~0.49 mg·kg-1；除草甘膦含量最高（0.49 mg·kg-1）的样品同时检出氨甲基膦酸（0.026 mg·kg-1）外，其余样品均未检出氨甲基膦酸。该样品草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸含量的测定结果总和以草甘膦计为0.53 mg·kg-1，小于国家规定草甘膦在茶叶中的最大残留限量（1 mg·kg-1）。

3 结论

本文采用气相色谱-质谱联用仪建立了绿茶中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的残留测定方法，通过衍生反应使强极性的草甘膦和氨甲基膦酸生成能被气相色谱柱分离测定的衍生化产物。试验结果显示，该方法杂质干扰小、重现性好、准确度高、检出限低，可满足绿茶中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的残留检测要求。

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Determination of Glyphosate and Aminomethyl Phosphonic Acid Residue in Green Tea by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

YANG Yaqin, FENG Shuhui, HU Yongjian, LI Yuanyuan, WANG Huifeng,LIU Jinxi, ZHONG Hongjian*

Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology, Henan Academy of Agricultural Sciences; Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-Products (Zhengzhou), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Zhengzhou 450002, China

An efficient method for the determination of glyphosate and its metabolite aminomethyl phosphonic acid (AMPA) in green tea was developed based on gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Green tea samples were extracted with water, preliminary purified by dichloromethane and followed by purification with PCX and HLB combined solid phase extraction columns, derived with trifluoroacetic anhydride (TFAA) and 2,2,3,3,4,4,4-heptafluoro-1-butanol (HFB), then determined by GC-MS. For glyphosate, the limit of quantification (LOQ) was 0.05 mg·kg-1, showing good linearity with coefficientR=0.999 3 in the concentration range from 2-100 ng·mL-1. For AMPA, itsLOQ was 0.02 mg·kg-1, showing good linearity with coefficientR=0.999 2 in the concentration range from 1-100 ng·mL-1. At the spiked levels of 0.25 mg·kg-1and 0.50 mg·kg-1, the average recoveries of glyphosate in green tea were 90.8% and 93.2%, with relative standard deviation (RSD) of 4.93% and 6.74%. At the spiked levels of 0.10 mg·kg-1and 0.20 mg·kg-1, the average recoveries of AMPA in green tea were 85.8% and 95.4%, with RSD of 10.5% and 5.16%. The proper impurity purification, small impurity interference and high recovery rate made this method suitable for residue detection of glyphosate and its metabolite APMA in green tea.

chromatography-mass spectrometry, glyphosate, aminomethyl phosphonic acid, green tea

S571.1；S482

A

1000-369X(2020)01-125-08

2019-04-07

2019-08-07

河南省农业科学院科研发展专项资金项目（YNK201710609、YNK20177513）

杨亚琴，女，助理研究员，主要从事农产品质量安全检测技术及风险评估研究。

80456811@163.com