α-烯醇化酶在肝癌中的表达及其联合甲胎蛋白在肝癌诊断中的应用价值

殷淑君 张 坤 蒋知新

(1 北京回龙观医院检验科，北京市 100096，电子邮箱：Yinshujunots@163.com；中国人民解放军第三〇五医院2 泌尿外科，3 中心实验室，北京市 100017)

肝癌是发病率和病死率均较高的恶性肿瘤之一。原发性肝癌按照病理类型可分为3种，其中90%为肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，因早期症状不明显，多数HCC患者发现时已经为中晚期[1]。目前，肝癌诊断主要依赖于影像学检查和组织活检，在肿瘤早期筛查及诊断方面仍存在困扰[2]。随着对肿瘤标志物的了解加深与重视，肿瘤相关蛋白标志物已成为重要的辅助诊断、判断预后和指导治疗的生物学指标[1]。甲胎蛋白为临床常规使用的肝癌相关血清学标志物，而妊娠、生殖腺胚胎癌和普通活动性肝病等患者也会出现甲胎蛋白的持续升高，且部分HCC患者，尤其是高分化和低分化或已坏死液化HCC患者的甲胎蛋白水平并不升高，因此亟须寻找新的更可靠的标志物。α-烯醇化酶(alpha-enolase,ENO1)作为糖代谢过程中的关键酶，在细胞能量代谢过程中发挥重要作用[3]。近年有大量研究证实了其表达量的变化与多种疾病之间密切相关[4-5]。也有研究证实，相对于正常癌旁组织，肝癌组织中的ENO1呈高表达，且ENO1的高表达可促进肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭[6-7]。以上提示ENO1可能为潜在的肝癌相关血清学指标，但目前关于ENO1在肝癌患者外周血中的表达研究极少。本研究旨在探究HCC患者外周血血清中ENO1蛋白水平在肝癌诊断中的意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2017年10月至2019年8月解放军总医院第七医学中心及中国人民解放军第305医院肝病科、肝胆外科、肿瘤科收治的所有HCC、肝硬化患者作为研究对象，其中90例HCC患者作为HCC组，45例肝硬化患者作为肝硬化组。均由经验丰富的临床医生严格按照相关指南[8-9]做出诊断。纳入标准：经实验室检查、影像学检查、病理学检查最终诊断为HCC或肝硬化且未接受过放疗、化疗及手术治疗的患者。排除标准：合并其他癌症患者；接受过手术、放化疗及其他抗肿瘤治疗者；其他原因导致的严重肝损害者或其他严重疾病；存在认知障碍和语言障碍、无法进行良好沟通者；临床资料不完善，不符合本研究需求者。另选取同期于上述医院体检中心进行健康查体者45例作为健康对照组。纳入标准：各项肿瘤标志物值均正常，影像学检查未发现结节、占位等。排除标准：肿瘤标志物检测存在异常，影像学检查发现结节、占位者；合并其他严重疾病者。HCC组年龄(58.58±9.59)岁，男性73例；肝硬化组年龄(60.58±11.28)岁，男性35例；健康对照组年龄(61.96±7.87)岁，男性36例。3组患者的年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究通过中国人民解放军第305医院医学伦理部门审查，所有调查对象在调查取样前均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样本的采集与保存：治疗前，所有研究对象均空腹12 h以上，于次日清晨采集空腹静脉血4 mL，采血后30 min内以3 000 r/min离心10 min，分离上层血清，记录患者信息及标本收集时间后将血清储存于-80 ℃冰箱待检。

1.2.2 ENO1的检测：采用ELISA法检测血清中的ENO1水平，人ENO1 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒(生产批号：ab181417)购自英国Abcam公司。(1)取出实验所需要的所有试剂，在室温下平衡30 min，按照说明书配制实验试剂。(2)配制ENO1标准蛋白溶液并进行梯度倍比稀释，稀释后浓度依次为800 ng/mL、400 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、25 ng/mL、12.5 ng/mL、0 ng/mL。(3)在96孔反应板中依次加入50 μL标准品或样本、50 uL抗体混合液，将反应板密封，室温下置于摇板机上孵育1 h，弃去孔中液体，每孔加入350 μL清洗液，清洗3次。最后一次清洗后，将反应板翻转过来，用干净的纸巾吸干多余的液体。随后，每孔加入100 μL 四甲基联苯胺反应底物，室温下避光放置于摇床上10 min。(4)每孔加入100 μL反应终止液，混匀1 min，采用Multiskan FC全自动酶标比色仪(美国赛默飞世尔科技公司)于450 nm处读取吸光度值。

1.2.3 甲胎蛋白的检测：采用电化学发光免疫分析系统(Cobas e601，罗氏集团)检测血清样本中的甲胎蛋白水平，试剂盒(生产批号：04491743)购自德国罗氏诊断有限公司。

1.3 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行统计分析。所有数据均进行正态性检验以确定资料是否符合正态分布，不符合正态分布的计量资料以中位数和四分位数[M(P25,P75)]表示，多组间比较采用非参数Kruskal-WallisH检验，组间两两比较采用拓展t检验。双变量之间的相关性采用Spearman相关分析。采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析各指标的诊断价值。ENO1或甲胎蛋白水平大于其单独诊断HCC的最佳截断值即判断为联合诊断阳性，反之则为阴性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组血清ENO1水平和甲胎蛋白水平的比较及其相关性 3组患者的血清ENO1水平、甲胎蛋白水平比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，且健康对照组、肝硬化组、HCC组的血清ENO1水平、甲胎蛋白水平均依次升高(均P<0.05)，见表1。双变量Spearman相关性分析结果显示，3组患者的ENO1水平与甲胎蛋白水平呈正相关(rs=0.393，P=0.002)。

表1 3组患者血清ENO1蛋白水平、 甲胎蛋白水平比较[M(P25,P75),ng/mL]

2.2 3组ENO1、甲胎蛋白水平及二者联合检测诊断HCC的ROC曲线分析 结果显示，ENO1、甲胎蛋白水平及二者联合检测诊断HCC的ROC曲线下面积分别为0.817(95%CI：0.755～0.879)、0.821(95%CI：0.756～0.886)、0.862(95%CI：0.809～0.914)(均P<0.05)，联合诊断的曲线下面积均大于ENO1、甲胎蛋白水平单独诊断(均P<0.05)。见表2、图3。

表2 ENO1、甲胎蛋白及二者联合检测 诊断HCC的效能

图3 ENO1联合甲胎蛋白诊断HCC的ROC曲线

3 讨 论

原发性肝癌是全球第五大常见肿瘤，其中90%为发病率和病死率均较高的HCC，有效的肿瘤标志物可以辅助诊断、判断预后和指导治疗。目前用于辅助诊断HCC的标志物主要为甲胎蛋白，但甲胎蛋白在诊断准确率方面存在一定限制[10]。因此，广大研究者正在寻找新的可以辅助肝癌诊断的标志物，并将多个标志物联合起来建立模型来提高诊断效能。本研究探讨了ENO1作为肝癌诊断血清标志物的潜在可能性，并评估了ENO1联合甲胎蛋白诊断肝癌的临床应用价值。

ENO1作为糖代谢过程中的关键酶，主要位于细胞质，可能通过肿瘤细胞损伤、坏死或者其他途径被释放到细胞外，从而进入外周血[11]。目前已有研究证实，相对于正常癌旁组织，肝癌组织中的ENO1呈高表达，且ENO1的高表达可促进肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭[6]。据此，我们推测HCC患者可能存在血清ENO1浓度升高的情况。本研究结果显示，相比于健康人群和肝硬化患者，HCC患者血清中的ENO1、甲胎蛋白水平明显升高(P<0.05)，这提示ENO1或可成为新的肝癌相关血清学标志物。预后分析发现，ENO1 mRNA高表达者的全因生存时间及无进展生存时间均短于ENO1 mRNA低表达者[7]，这提示肝癌组织中ENO1的表达情况与患者的病情进展、预后均存在关联。本研究中肝硬化组的ENO1、甲胎蛋白水平高于健康体检组(P<0.05)，提示ENO1在肝硬化期已开始轻度升高，但因本研究纳入的肝硬化、HCC患者均为肝炎患者，结合肝炎、肝硬化、肝癌的经典临床进展过程分析，我们认为通过检测血清ENO1水平的变化或可早期预测肝炎肝硬化患者的进展，这为肝癌的早期筛查提供新的思路和依据，但这还需要根据患者的情况进行细分，并需通过进一步实验去验证。

本研究结果显示，ENO1、甲胎蛋白对HCC具有较高的诊断效能，但ENO1联合甲胎蛋白诊断HCC的曲线下面积高达0.862，高于任一指标单独检测(均P<0.05)，这提示二者联合检测可有效辅助临床诊断HCC。二者联合检测虽然提高了敏感度(93.3%)，但该方法的特异度较低，因此联合检测更适合用于HCC的筛查。

综上所述，ENO1或可成为新的肝癌相关血液学标志物，其诊断HCC具有一定的临床应用价值。联合使用甲胎蛋白和ENO1可获得比单个标志物更强的辅助诊断效能，因此ENO1可作为甲胎蛋白诊断HCC的互补指标，推荐两者联合使用以提高诊断的准确性。