血清微小RNA-424联合血清人胎球蛋白A抗体、精子相关抗原9抗体诊断乳腺癌的价值▲

李宗龙 李 英 白文辉 马志娟 沈国双

(青海红十字医院1 乳腺外科，2 手术室，西宁市 810000，电子邮箱：lizonglong2893@163.com；3 青海大学附属医院乳腺甲状腺外科，西宁市 810000)

乳腺癌发病率占女性肿瘤首位，且近年来呈上升趋势，严重威胁女性身心健康[1]。由于乳腺癌早期临床症状不明显，大多数患者确诊时已错过最佳治疗时期，严重影响患者的生存质量。因此，早诊断、早治疗是提高乳腺癌患者生存质量的有效手段。微小RNA(microRNA，miRNA)-424参与细胞增殖、转移及凋亡等过程，其异常表达与乳腺癌的发展进程有关[2]。人胎球蛋白A又称α2-HS糖蛋白(alpha-2-Heremans-Schmid glycoprotein，AHSG)，其抗体具有多种生物学功能，对乳腺癌患者的早期诊断及预后评估有指导意义[3-4]。精子相关抗原9(sperm-associated antigen 9，SPAG9)抗体与多种肿瘤的生长、侵袭及迁移有关，在乳腺癌患者中SPAG9抗体水平升高可作为乳腺癌患者早期诊断和疗效评价的重要指标之一[5]。血清miRNA-424、AHSG抗体、SPAG9抗体单独诊断乳腺癌的准确度较低，容易出现漏诊、误诊，因此，本研究分析血清miRNA-424、AHSG抗体、SPAG9抗体三者联合检测对乳腺癌的诊断价值，以期为早期诊断乳腺癌提供参考。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2016年10月至2018年10月青海红十字医院乳腺外科收治的58例乳腺癌患者作为研究对象(乳腺癌组)，同时选取同时期该医院收治的55例乳腺纤维腺瘤患者为良性疾病组，两组患者均经病理确诊[6]；另选取同时期在该医院体检的51例健康女性为健康对照组。3组研究对象的纳入标准：(1)临床资料或体检资料完整；(2)采集静脉血前未接受任何手术治疗。排除标准：(1)既往有其他恶性肿瘤病史者；(2)既往有免疫系统疾病病史者；(3)近3个月有重大外伤或感染病史者；(4)肝、肾功能异常者。乳腺癌组年龄31～77(50.68±13.64)岁；浸润性导管癌42例，导管内癌11例，乳腺黏液癌5例；临床分期Ⅰ期17例，Ⅱ期29例，Ⅲ期12例。良性疾病组年龄30～77(49.85±12.20)岁，健康对照组年龄30～76(49.97±12.51)岁。3组研究对象的年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具体可比性。本研究经青海红十字医院医学伦理委员会批准，所有研究对象或其家属均对本研究知情，并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样本采集与保存：乳腺癌组和良性疾病组患者均于住院第二天清晨采集空腹静脉血5 mL，健康对照组女性于体检当天清晨采集空腹静脉血5 mL，均在10℃～15℃下3 000 r/min离心5～10 min，取上清液，保存于-80℃冰箱，在12 h内检测血清miRNA-424、AHSG抗体、SPAG9抗体水平。

1.2.2 血清miRNA-424相对表达量检测：采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)法检测3组受试者的血清miRNA-424相对表达水平，qRT-PCR仪购自瑞士罗氏公司(型号：LightCycler 96)。采用TRIzol Reagent试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司，批号：20150212)提取血清总RNA，反转录(37℃，60 min；85℃，5 s)得cDNA。以U6作为内参扩增miRNA-424，引物序列见表1。qRT-PCR反应体系共20 μL：cDNA(50 ng/μL)2 μL，miScript SYBR® Green Mix 10 μL，上下游引物(10 μM)各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。反应程序：95℃ 30 s；95℃ 10 s；60℃ 15 s；70℃ 20 s；共40个循环。qRT-PCR反应均设置3个复孔，反应结束后，取平均值，采用2-ΔΔCt法计算血清miRNA-424相对表达水平。

表1 引物序列

1.2.3 血清AHSG抗体、SPAG9抗体水平检测：采用酶联免疫吸附试验检测血清AHSG抗体、SPAG9抗体水平。人AHSG抗体、人SPAG9抗体标准品均由北京雅安达生物技术有限公司提供(批号：20150612)，具体操作参照说明书进行。取出实验所需板条，空白孔加入标准品和标本稀释液，其余孔加入不同浓度标准品(100 μL/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵育箱孵育90 min；洗板5次；空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100 μL/孔)，用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵育箱避光孵育30 min；洗板5次，加入显色底物(四甲基联苯胺)100 μL/孔， 36℃避光孵育15 min。加入终止液100 μL/孔混匀后，终止反应，然后以空白孔为标准进行调零，3 min内依序测量各孔在450 nm波长下的吸光度(OD)值，根据所得的标准曲线和OD值计算每个标记物在血清中的相应浓度。

1.2.4 乳腺癌诊断标准：本研究采用串联试验，单独诊断时采用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC) 曲线的最佳截断值为诊断界值，大于AHSG抗体、SPAG9抗体截断值或小于miRNA-424截断值时诊断为乳腺癌，联合诊断时需同时满足单独诊断的条件方能诊断为乳腺癌。

1.3 统计学分析 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验；计数资料以频数和百分比表示，比较采用χ2检验；采用ROC曲线分析各指标单独及联合诊断乳腺癌的效能。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组血清miRNA-424相对表达水平、AHSG抗体及SPAG9抗体水平比较 健康对照组、良性疾病组、乳腺癌组血清miRNA-424相对表达水平依次降低，血清AHSG抗体、SPAG9抗体水平依次升高(均P<0.05)。见表2。

表2 三组血清miRNA-424相对表达水平、AHSG抗体及SPAG9抗体水平比较(x±s)

2.2 乳腺癌患者血清miRNA-424相对表达水平、AHSG抗体及SPAG9抗体水平与临床分期的关系 乳腺癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者的血清miRNA-424相对表达水平依次降低，血清AHSG抗体、SPAG9抗体水平依次升高(均P<0.05)。见表3。

表3 血清miRNA-424相对表达水平、AHSG抗体及SPAG9抗体水平与乳腺癌临床分期关系(x±s)

2.3 各指标单独及联合检测诊断乳腺癌的ROC曲线分析 以乳腺癌组和良性疾病组患者为研究对象，分析血清miRNA-424、AHSG抗体、SPAG9抗体水平单独检测及联合检测诊断乳腺癌的效能。结果显示，血清miRNA-424、AHSG抗体、SPAG9抗体、miRNA-424联合AHSG抗体、miRNA-424联合SPAG9抗体诊断乳腺癌的曲线下面积分别为0.796、0.846、0.866、0.902、0.868，三者联合检测诊断乳腺癌的曲线下面积为0.927。三者联合检测的曲线下面积高于miRNA-424水平单独检测(P<0.05)，而三者联合检测的曲线下面积与其他各项指标单独检测比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表4、图1。

表4 各指标单独及联合检测诊断乳腺癌的ROC曲线分析结果

图1 各指标单独及联合检测对乳腺癌诊断价值的ROC曲线

2.4 各指标单独及联合检测诊断乳腺癌的效能 各组检测方法的准确度及阴性预测值比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，血清miRNA-424、AHSG抗体、SPAG9抗体三者联合检测诊断乳腺癌的准确度高于AHSG抗体单独检测(P<0.05)，而各组阴性预测值的两两比较差异均无统计学意义(均P>0.05)；各检测方法的灵敏度、特异度和阳性预测值差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表5。

表5 血清miRNA-424、AHSG抗体、SPAG9抗体水平单独及联合检测诊断乳腺癌的效能[%(n/N)]

3 讨 论

乳腺癌发生于乳腺上皮组织，主要临床表现有乳腺肿块、乳头溢液及腋窝淋巴结肿大等，且发病年龄趋于年轻化，大多数乳腺癌患者确诊时已处于中晚期，治疗预后较差[7]。因此，探索新的肿瘤标志物，对于在乳腺癌发展早期发现疾病并尽早采取有效治疗手段，降低死亡率具有重要意义。由于临床常规检查不能满足早期诊断乳腺癌的需求，易延误病情，而血清miRNA-424、AHSG抗体、SPAG9抗体在检测乳腺癌上具有良好的临床应用前景。因此，本研究比较上述3个指标单独及联合检测对乳腺癌的诊断效能，以期为乳腺癌的早期诊断和临床治疗提供新方向。

miRNA是一类非编码单链小分子RNA，在真核生物中广泛存在，参与细胞生长、发育等过程，与多种疾病的发生、发展有关[8]。miRNA具有高度保守性，通过与靶标基因3′端非翻译区配对，能调控细胞增殖、凋亡等多种生物学功能。miRNA-424位于人染色体Xp26.3，在宫颈癌患者中表达失调，并与肿瘤侵袭、转移密切相关[9]。栾磊等[10]发现，宫颈组织中miRNA-424水平与宫颈癌病变严重程度有关，宫颈病变越严重，miRNA-424水平越低。本研究结果显示，乳腺癌患者血清miRNA-424相对表达水平最低、乳腺良性疾病患者次之、健康对照组最高(P<0.05)；且乳腺癌Ⅲ期患者血清miRNA-424相对表达水平最低、Ⅱ期次之、Ⅰ期最高(P<0.05)，与上述研究结果相似，表明血清miRNA-424表达下调可能与乳腺癌的发生、发展有关，其或可作为早期筛查和诊断乳腺癌的血清学肿瘤标记物。但ROC曲线分析结果显示，血清miRNA-424诊断乳腺癌的曲线下面积较小，且特异度和灵敏度也较低，因此其单独检测诊断乳腺癌的价值不高，应与其他指标联合诊断乳腺癌。

AHSG是由肝脏细胞分泌合成的糖蛋白，位于人3号染色体，包含6个内含子和7个外显子，具有调节钙化、胰岛素抵抗及负性应激等生物学功能[11]。AHSG为肿瘤相关抗原，其抗体可作为肿瘤筛查的血清标记物。SPAG9位于人染色体17p21.33，通过与c-Jun氨基端激酶结合，参与调节多种生理功能[12]。研究显示，SPAG9在人体多种肿瘤中均有表达，且可诱发机体内的自身免疫反应产生SPAG9抗体，而SPAG9抗体表达异常与前列腺癌、肺癌等多种肿瘤的发生、发展有关，在肿瘤早期诊断及靶向治疗方面具有一定作用[13-14]。李琳[15]发现，妊娠期糖尿病患者血清AHSG水平明显高于健康孕妇，与糖脂代谢紊乱关系密切。Nimptsch等[16]的研究显示，大肠癌患者血清AHSG表达上调，其表达异常与大肠癌发展进程有关。毛立军等[17]发现，前列腺癌组织中的SPAG9蛋白阳性率明显高于前列腺增生组织，表明SPAG9参与前列腺癌的发生和转移。还有学者发现，乳腺癌组织中SPAG9蛋白的异常表达与病变大小、淋巴结转移及术后复发有关，提示SPAG9表达上调是乳腺癌患者预后不良的独立危险因素[18]。本研究中，乳腺癌患者血清AHSG抗体和SPAG9抗体水平最高、乳腺良性疾病患者次之、健康女性最低，且乳腺癌临床分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者的血清AHSG抗体和SPAG9抗体水平依次升高(均P<0.05)，与上述研究结果相似[14-17]，表明血清AHSG抗体、SPAG9抗体水平可反映乳腺癌病情变化，或可作为诊断和治疗乳腺癌的新靶点。本研究ROC曲线分析结果显示，血清AHSG抗体、SPAG9抗体单独诊断乳腺癌的灵敏度高，但特异度均较低，提示血清AHSG抗体、SPAG9抗体单独诊断乳腺癌容易出现误诊现象，延误患者病情。进一步研究发现，血清miRNA-424、AHSG抗体、SPAG9抗体三者联合检测诊断乳腺癌的ROC曲线下面积较大，且准确度高于AHSG抗体单独检测，但三者联合检测的曲线下面积仅高于血清miRNA-424单项检测时的曲线下面积(P<0.05)，而与其他各项指标检测的曲线下面积差异无统计学意义(均P>0.05)。这提示单独检测一个或两个指标诊断乳腺癌有一定的局限性，而三者联合检测虽然能提高乳腺癌的诊断效能，但是提高幅度不大，分析其原因可能是由本研究纳入的样本量较少造成的，因此今后还有待进一步扩大样本量来分析三者联合检测是否适用于乳腺癌的临床诊断，并筛选出具有较高灵敏度和特异度的指标，以达到节省医疗成本，提高诊断效能的目的。

综上所述，乳腺癌患者血清miRNA-424相对表达水平降低、AHSG抗体和SPAG9抗体水平升高，三者联合检测诊断早期乳腺癌的效能较高，今后还需加强对乳腺癌临床筛查指标的研究。