间隙连接蛋白43的功能及温度响应性研究进展

丁萌楠，宋伦

军事医学研究院 军事认知与脑科学研究所，北京 100850

间隙连接（gap junction，GJ）是细胞间通道，由被称为连接蛋白（connexin，Cx）的跨膜蛋白的6个亚基形成，介导相邻细胞的细胞质之间的直接通讯。细胞间的这些通道允许细胞之间交换小分子（<1000 Da），包括离子、氨基酸、核苷酸、代谢物和第二信使物质（如钙、葡萄糖、cAMP、cGMP、IP3）等。间隙连接介导的间隙连接通讯（gap junctional intracellular communication，GJIC）在组织稳态、细胞生长和分化等生物过程中起主要作用。GJIC可在转录、转录后、翻译后等多个水平被调控，并且细胞间隙连接可以在各种刺激下被精细调节，包括膜电位、细胞钙浓度和pH值的变化以及连接蛋白的磷酸化状态。

1 Cx43的结构与功能

Cx基因是一个多基因家族，在人类基因谱中有21位成员，拥有一个长内含子（6～8 kb）及2个外显子，外显子1主要包含5'非编码区，而所有的蛋白编码序列及3'非编码区均集中在外显子2中。编码间隙连接蛋白43（Cx43）的基因位于染色体6q22.3，其mRNA全长约3.1 kb。Cx43蛋白在内质网中合成，并通过高尔基体转运至质膜。连接蛋白是具有细胞内N端和C端的四跨膜（TM）结构域蛋白。2个细胞外环（E1和E2）分别连接TM1-TM2和TM3-TM4，而TM2和TM3之间的区域位于细胞内，并形成胞内环（CL）[1]。Cx43蛋白的N端较短且保守；C端较长（约150个氨基酸残基），含有众多丝/苏氨酸、酪氨酸残基，是多种蛋白激酶/磷酸酶、信号通路的作用位点。未成熟的Cx43蛋白最初被翻译为40 kD的蛋白链，其在合成后不久被磷酸化。蛋白质的磷酸化状态在通过内质网和高尔基体运输到质膜时发生变化，最终形成间隙连接通道。Cx43在SDS-PAGE中迁移为多条带，通常标记为P0、P1和P2，代表不同的磷酸化状态[2]。

间隙连接通道具有相似的整体结构，但其通透性和门控特性取决于连接蛋白同工型及其翻译后修饰。Cx在大多数组织和器官中表达，其中Cx43的表达最为广泛且研究最多。Cx43在广泛的生理过程中起关键作用。Cx43调节各种器官包括骨骼[3]、大脑[4]、骨髓[5]和心脏[6]的发育过程，也在心肌细胞和平滑肌增殖分化[7-8]、神经元信号传导[9]中发挥重要作用，还参与内分泌腺和外分泌腺的激素分泌和功能、听觉功能[10]、伤口愈合[11]、精子发生、类固醇生成、卵泡发育、排卵和黄体形成等生殖功能[12-13]，以及组织炎症和组织修复等免疫调节功能[14]。此外，Cx43的表达与癌症复发、转移扩散及不良预后相关[15]。同时，Cx43还具有膜通道功能非相关的细胞增殖调节能力[16]。

2 Cx43的表达调控

2.1 Cx43基因的转录表达调控

Cx43基因启动子区域存在AP1、SP1及Smad等转录因子结合位点。生物钟基因Rev-erbα可以与Cx43基因启动子区的SP1结合位点结合，影响Cx43的活性和周期震荡变化，参与膀胱容量的昼夜变化[17]。蛋白酶激活受体1（PAR-1）作为介导黑色素瘤转移的关键因素，可通过介导AP1和SP1转录因子结合与Cx43基因启动子进而调节Cx43表达并影响黑色素瘤的转移[18]。转化生长因子β1（TGF-β1）和骨形态发生蛋白（BMP）可以激活Smad而影响卵巢部位颗粒细胞中Cx43的表达及细胞间通讯[19]。Cx43的转录表达也受Wnt信号途径调控，在心肌或骨骼肌细胞，Wnt信号通路的激活可通过调节β钙黏蛋白的转录活性进而诱导Cx43表达和间隙连接通道形成[20]。此外，激素也可以调节Cx43的表达，在Cx43基因启动子区域有雄激素受体（AR）和糖皮质激素受体（GR）等多种激素受体反应元件，因而雌激素可以直接通过ER-α上调Cx43[21]，也可以通过上调c-fos和cjun mRNA的表达而间接上调Cx43。高水平的雄激素可通过雄激素受体途径降低Cx43表达并削弱人颗粒细胞之间的间隙连接细胞间通讯，最终导致卵泡生成受损[22]。

2.2 Cx43蛋白的磷酸化修饰反应调控

缝隙连接蛋白的翻译后修饰反应以磷酸化为典型特征，且磷酸化与间隙连接通讯的调控有关，包括细胞内连接蛋白运输、连接子组装和拆卸、连接蛋白降解以及间隙连接通道的门控等。

Cx43磷酸化具有复杂性和多样性。Cx43的C端区域有19个丝氨酸和2个酪氨酸残基为磷酸化位点，它们能够在蛋白激酶催化作用下实现磷酸化修饰反应并调节间隙连接的稳定性和功能。参与Cx43磷酸化修饰反应的信号分子包括蛋白激酶C（PKC）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Src蛋白以及连接蛋白伴侣（例如ZO-1和 tublin）等[2]。Ser262、Ser368、Ser279和 Ser282的磷酸化修饰反应已被确定与PKC、MAPK和PKA途径活化相关；并且一种激酶可以催化一个以上的位点发生磷酸化反应，而一个位点也可以同时被多种激酶和信号传导途径催化而实现磷酸化反应。AKT可介导Ser373位点的磷酸化修饰反应，这一反应具有分子“开关”功能，可促使Cx43失去与ZO-1之间的相互作用，进而增加间隙连接通讯。Cx43在Ser373位点的磷酸化修饰反应在正常心脏组织中低水平维持，在缺氧应激后急剧增加，Ser373位点的磷酸化在缺氧时增加了心肌细胞对损伤的反应并维持了细胞间通讯[23]。PKCε的表达与Ser262位点的磷酸化有关，研究表明Ser262位点的磷酸化反应可表现出心脏对缺血的适应反应，并起到保护作用[24]。当皮肤受到损伤后，AKT介导Ser373位点的磷酸化反应水平增加可能影响角质形成细胞的激活和迁移，从而促进伤口愈合[23]。12-0-十四烷（酰）-13-乙酯（TPA）和表皮生长因子（EGF）可激活ERK1/2介导Ser279/Ser282位点的磷酸化修饰反应[2]，肌醇1，4，5-三磷酸受体（IP3R）可通过影响心室肌细胞Ser279/Ser282位点的磷酸化修饰反应进而调节细胞间的通讯[25]。Cx43的另一个特殊磷酸化位点是Ser368，可通过PKC活化实现磷酸化修饰反应，高剂量胰岛素可通过活化PKC并磷酸化Cx43从而抑制血管平滑肌细胞的间隙连接通讯[26]。生长因子（如VEGF）可以激活PKC和MAPK并分别介导 Ser255、Ser262、Ser279/Ser282和 Ser368位点的磷酸化修饰反应，进而诱导GJs内在化[27]。酪蛋白激酶1（CK1）诱导的Ser325、Ser328或Ser330位点的磷酸化修饰反应可调节正常大鼠肾细胞中Cx43间隙连接组装[1]。Src激酶可激活Tyr247和Tyr265位点的磷酸化修饰反应，并导致间隙连接通讯的下调和Cx43蛋白表达水平的降低[28]。Src还可以激活其他激酶（包括ERK1/2、PKC和MAPK），从而影响通道门控和间隙连接稳定性。Src激活PKC介导Cx43的磷酸化修饰反应可导致GJs的减少和Cx43半衰期的缩短。针对睾丸癌的药物吉非替尼通过抑制Src和PKC表达而诱导GJIC表达水平增强[29]。Na/K-ATPase（ATP1A1）通过Src-EGFR-ERK1/2-CREB途径调节睾丸支持细胞紧密连接和间隙连接[30]。ZO-1与GJ相互作用，并与GJ斑块的外围结合而产生新合成通道。ZO-1与Cx43的C端区域相互作用会改变间隙连接大小。机体受到损伤或缺氧会诱导AKT活化并介导Ser373位点的磷酸化修饰反应，这可导致ZO-1从Cx43 GJs分离，因此Ser373位点的磷酸化/去磷酸化修饰反应平衡可调节Cx43/ZO-1相互作用[23]。

2.3 Cx43蛋白的泛素化与降解

Cx43是不稳定蛋白，可通过溶酶体-自噬途径与泛素化-蛋白酶途径实现降解。其中，溶酶体主要在破坏内化的间隙连接及降解从早期分泌泡中传递来的Cx43[31]，其中肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物（Hrs）和肿瘤易感基因101（Tsg101）是Cx43向溶酶体运输的关键调节剂，它们还是转运所需的内体分选复合物（ESCRT）的组成部分，二者可协同结合泛素化修饰的Cx43进而调节其经溶酶体途径的降解[32]。泛素化-蛋白酶体降解途径主要介导降解内质网中新合成的Cx43。CIP75是介导Cx43进入蛋白酶体降解途径的关键调节因子，它可与Cx43相互作用并促进Cx43与蛋白酶体结合而实现降解反应[33]。此外，在缺血性心肌细胞中，Cx43的降解是通过自噬途径介导发生，这一过程需要Cx43的泛素化以及p62和表皮生长因子受体底物15（Eps15）的协同参与[34]。研究发现，泛素化在间隙连接斑（gap junction plaque，GJP）的内化反应中发挥重要作用。E3泛素连接酶Nedd4是第一个被发现与Cx-43泛素化修饰反应相关的酶，其与Cx43 C端上富含脯氨酸（PY）的基序结合并介导静息状态下Cx43的泛素化和降解反应[35]。在缺血状态下，Nedd4基因敲除未对Cx43水平产生任何显著影响，这表明还存在除Nedd4外的其他E3泛素化连接酶介导Cx-43的泛素化修饰反应。Smad泛素化调节因子2（Smurf2）是调节Cx43泛素化修饰反应的另一个E3泛素化连接酶，可介导TPA刺激作用下Cx43的磷酸化和泛素化降解反应，阻断Smurf2表达可显著降低CX-43降解并可导致间隙连接斑的增加及间隙连接细胞间的通讯增加[36]。E3泛素连接酶TRIM21与Cx43的相互作用可调节质膜和GJIC上Cx43的水平，研究发现这种相互作用需要Cx43磷酸化的诱导，从而促进泛素化和蛋白水解降解GJV。

3 Cx43在温度变化中的反应

研究表明，Cx43是温度响应性信号蛋白。寒冷应激条件下，Cx43在米色脂肪和棕色脂肪细胞中的表达水平显著上调，细胞间通讯增加，这是通过交感神经元活化以及脂肪组织中β3肾上腺素能受体激活而介导实现，并且敲除Cx43的小鼠不耐寒[38-39]。此外，冷暴露的大鼠，肾上腺嗜铬细胞间隙连接通讯增强且与Cx43的增加相一致，间隙连接偶联的这种上调导致嗜铬细胞之间出现牢固的电偶合，从而允许在偶联细胞之间传递动作电位。冷应激暴露会刺激肾上腺髓质和蓝斑的儿茶酚胺能系统，而嗜铬细胞之间间隙连接通讯的上调可能是一种使肾上腺髓质系统敏感的内源性机制[40]。冬眠过程中仓鼠心肌细胞中的Cx43间隙连接蛋白增加可能是一种代偿性反应，以便在生理条件下保持足够的缝隙连接通讯[41]。Cx43的过表达可以防止心肌细胞冷保存诱导的损伤，冷应激诱导Cx43在Ser262位点的磷酸化修饰反应可能在供体心脏的保存中起重要作用[42]。

高温应激条件下，Cx43表达水平下调。早先研究表明，热应激可增加心肌细胞间隙连接蛋白的水解[43]。大鼠牙髓细胞的热暴露反应中也发现了间隙连接蛋白Cx43的迅速降解反应，并在后续6 h内可恢复到正常水平，表明牙髓细胞具有包括热激蛋白（HSP）在内的保护因子，并且在热暴露后可恢复细胞间通讯能力[44]。肌腱细胞的热应激反应研究表明GJIC参与了热应激诱导的分解代谢和促炎症反应调节[45]。此外，热应激可增强Cx43的磷酸化修饰反应，从而导致GJIC功能丧失，并且在致癌过程中加剧了高温致死性。在牛卵丘卵母细胞复合物（COC）的热应激反应研究中，发现COC中间隙连接的通透性主要受ERK1/2依赖性磷酸化修饰反应调节，同时伴随Cx43磷酸化修饰水平的上调。所以，热应激可能通过COC中各种激酶影响连接蛋白多个磷酸化位点上的修饰反应，进而调节间隙连接通讯[46]。

4 结语

我们已经对Cx43连接蛋白的各种表达调控以及它的降解途径有了较为清晰的认识，但目前对于Cx43不同内在化机制的调控仍未全面了解。间隙连接结构响应各种特定信号的快速转换，细胞可以迅速改变与相邻细胞间信号传导和通讯，冷热刺激通过间隙连接组成蛋白Cx43的表达进行调节，从而参与GJIC的调控。冷刺激通过增加Cx43的表达，以便在特殊条件下保持足够的缝隙连接通讯间隙。热应激会引起Cx的下调，导致GJIC功能丧失进而影响细胞功能。机体对于冷热刺激会出现适应性反应，冷热刺激后Cx43的表达改变可能是机体面对外来刺激的生理或病理反应。但是冷热刺激对于不同组织器官的具体调控机制还未完全明确，通过连接蛋白的特异性敲除或修饰，我们能够在未来阐明它在不同组织器官中的特定作用，这可能会成为Cx43与温度相关研究的新方向以及疾病相关的药理学靶标。