基质金属蛋白酶9与缺血性脑卒中的研究进展

杨佳蕾，尹世敏，陈华蕾

1.国家神经系统疾病临床医学研究中心，北京 100070；2.火箭军特色医学中心，全军脑卒中医疗救治研究中心 神经内科，北京 100088；3.首都医科大学附属北京地坛医院 肿瘤诊治中心，北京100015

卒中是我国居民的第一位死亡原因，也是伤残调整生命年的首要原因以及寿命损失年的主要原因之一。卒中可以分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中约占87%[1]。缺血性脑卒中的损伤机制尚未完全清楚，主要与缺血缺氧后血脑屏障破坏、炎性反应、细胞死亡、兴奋性毒性物质释放、细胞内钙超载及氧化应激等有关。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在神经发生、神经细胞迁移、突触生长、髓鞘形成、血管生成、神经损伤后修复再生等过程中发挥了重要作用。在不同生理和病理条件下，各种刺激因素如生长因子、细胞因子和活性氧等都可以影响MMPs的表达及活性[2]。在缺血性脑卒中后，MMPs的表达谱发生变化，并且参与破坏血脑屏障（blood-brain barrier，BBB），导致神经细胞死亡、炎性反应、脑水肿、脑出血、髓鞘降解以及神经功能缺损[3]。在MMPs家族中，MMP-9的作用尤为显著。本文对MMP-9在缺血性脑卒中的损伤及修复中的作用机制进行综述，以期为缺血性脑卒中提供新的诊疗靶点。

1 MMP概述

MMPs是一类锌依赖性内肽酶，可降解几乎所有的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分，其作用底物十分广泛，包括趋化因子、生长因子及其结合蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂以及细胞内蛋白，从而起到相应的生理病理作用[4]。人体内表达的MMPs多达25种，其结构从N端到C端包括以下5个部分，即信号肽、前肽、催化结构域、铰链区和血红素结合蛋白样C端区[5]。MMPs可以广义地分为组织型（如MMP-2及MMP-14）和诱导型（MMP-3及MMP-9）。根据MMPs的结构和底物特异性，可进一步分为以下几种亚型，即明胶酶（gelatinases）、胶原酶（collagenases）、间质溶解素（stromelysins）、基质溶解素（matrilysins）、膜型 MMP（membrane-type MMP，MT-MMP）和其他类型MMP。MMP-9是MMPs亚家族中的一种，又称为明胶酶B（gelatinase B）。人MMP-9由染色体20q13.12基因编码表达，其酶原的相对分子质量为92 000，经过剪切后其活性形式的相对分子质量为83 000。MMP-9可以由中性粒细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞等分泌，主要在细胞外空间起作用。MMP-9可以分解Ⅳ型胶原蛋白、Ⅴ型胶原蛋白、弹性蛋白、纤维连接蛋白、变性间质蛋白等多种ECM成分，在组织发育、损伤与修复中起重要作用[6-7]。

2 MMP-9与缺血性脑卒中

MMP-9在正常脑组织中低表达，但在缺血性脑卒中后表达增加，通过破坏BBB、促进炎性细胞浸润及炎性因子释放、诱发神经细胞死亡、缺血组织出血转化等诸多机制参与脑组织损伤。

2.1 MMP-9与血脑屏障

BBB是中枢神经系统和外周组织的物理屏障，由内皮细胞及其紧密连接、周细胞、星形胶质细胞足突以及基膜构成，可以阻碍毒性物质、炎症因子、炎细胞进入中枢神经系统，从而维持脑内环境稳定。构成BBB的蛋白质分子如紧密连接蛋白、转运蛋白、白细胞黏附分子、基底膜蛋白等，对调控其通透性起重要作用[8]。在脑缺血早期，MMP-9主要由中性粒细胞分泌，之后以小胶质细胞和巨噬细胞为主。缺血区局部的神经元、血管内皮细胞和神经胶质细胞也可过表达MMP-9[9-10]。脑缺血后4～6 h MMP-9活性显著升高，48 h达到高峰，72 h或更长时间恢复至基线水平。由于动物研究模型不同，MMP-9改变的时程也有所变化，但既往研究报道MMP-9的活性增加时程与血脑屏障降解、通透性增加密切相关[9-11]。

真核细胞中存在由纤维蛋白网构成的细胞骨架，可以维持细胞形态并影响细胞运动，其中由肌动蛋白构成的微丝具有细胞连接与屏障功能。脑组织缺血缺氧诱导MMP-9表达上调可以导致血管内皮细胞中的微丝发生断裂或重构，进而增加BBB的通透性[12]。MMP-9在分解BBB基底膜蛋白的同时，降低了血管内皮细胞间紧密连接蛋白的表达，导致血管源性水肿、出血转化和死亡率增加[13-14]。MMP-9还可以诱导免疫炎症反应，调控各种细胞因子和炎症趋化因子活性，如TNF-α、ICAM-1、CXCL12等[7,15]。与此同时，促炎因子迅速激活脑内组织型免疫细胞即小胶质细胞，并广泛募集炎症细胞，如中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞、不同亚型的T细胞和其他炎性细胞。其中，中性粒细胞最早渗入脑组织并释放MMP-9[11]。但是，既往研究表明，中性粒细胞可以表达癌胚抗原相关细胞黏附分子1（carcinoembryonic antigen-related celladhesion molecule 1，CEACAM1）。采用CEACAM1敲除小鼠制作脑缺血模型，分泌MMP-9的中性粒细胞增加导致血脑屏障破坏加剧。由此可见调控CEACAM1+中性粒细胞与分泌MMP-9的中性粒细胞的亚群平衡可能成为治疗靶点[16]。周细胞是神经血管单元的组成部分，对维持BBB完整性起重要作用。既往研究结果证明，缺血性脑卒中早期周细胞是神经血管单元中最易受损且最早死亡的细胞，其死亡可以直接导致BBB完整性受损。另一方面，在体双光子成像显示，血管内血液外渗主要发生在周细胞胞体与毛细血管壁密切接触的部位，而这一分布不均匀的渗漏主要与周细胞分布不均以及周细胞在炎症刺激下分泌的MMP-9有关[17-18]。由此可见，缺血性脑卒中后MMP-9可通过多种途径直接或间接破坏BBB、增加血管通透性，同时缺血灶局部产生的趋化因子促使血液循环中的炎细胞浸润，加重炎症反应引起的组织损伤，故MMP-9介导的BBB破坏是引起脑缺血损伤的重要机制之一。

2.2 MMP-9与神经细胞死亡

MMP-9介导的神经元凋亡与ECM的破坏有关。ECM是由胶原蛋白、弹性蛋白、纤维连接蛋白和蛋白聚糖组成的非细胞性三维分子网络。ECM不仅为神经细胞提供物理支撑，还能够调节细胞生存、生长、迁移和分化[19]。在脑缺血后，过表达的MMP-9降解ECM，进而破坏神经细胞与ECM间的相互作用，使其与ECM的黏附性下降并脱离，激活死亡受体介导的外源性信号通路或线粒体参与的内源性信号通路，导致神经元凋亡。这种由于细胞与ECM分离或相互作用发生异常而诱发的细胞程序性死亡又称为失巢凋亡[20]。除此之外，脑缺血后产生的一氧化氮介导S-亚硝基化（S-nitrosylation）反应激活MMP-9可以直接引起神经元凋亡，而给予MMP抑制剂GM6001或明胶酶抑制剂SB-3CT可以阻断神经元凋亡、减小脑梗塞体积、改善神经功能[21-22]。除了局灶脑缺血可以引发大量神经元凋亡，全脑缺血后部分区域如海马、皮层特定亚层也会发生选择性神经元死亡。在全脑缺血后，海马MMP-9表达显著上调，而采用广谱MMP抑制剂BB-94或敲除MMP-9后神经元死亡显著减少[23]。上述研究表明，MMP-9可以通过直接或间接途径诱导神经细胞死亡，局灶给予MMP-9特异性抑制剂可能为减少神经元死亡、减轻神经功能损伤提供新的治疗方法。

2.3 MMP-9与出血转化

出血转化是缺血性脑卒中的严重并发症，可以引起神经功能的突然恶化，既往研究提示MMP-9的过表达与出血转化关系密切。对于急性脑出血且未采用重组组织型纤溶酶原激活剂（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）溶栓的患者，有研究对比了出血转化及非出血转化患者血浆中MMP-9的含量，发现出血转化组外周血MMP-9的含量明显升高，并且通过多因素分析校正其他危险因素发现，急性脑出血患者发病24 h内血浆MMP-9水平可以作为发生脑缺血后出血转化的独立预测因素[24-25]。对于急性脑出血且采用rt-PA的患者，rt-PA在改善卒中预后的同时，也在一定程度上增加了出血转化的风险。rt-PA静脉溶栓前，患者外周血MMP-9水平不但是溶栓后出血转化最强有力的预测因子，并且其水平高低与出血转化程度有明确相关性[26]。既往有前瞻性研究验证了溶栓前MMP-9≥140 ng/mL可以预测rt-PA静脉溶栓后的出血转化事件[27]。机制研究提示，rt-PA可以通过低密度脂蛋白受体相关蛋白（low-density lipoprotein receptor related protein，LRP）上调人脑微血管内皮细胞的MMP-9 mRNA，进而增加蛋白水平，破坏BBB并导致出血转化[28]。除此之外，诸多基础疾病如高血压、糖尿病和血脂异常等均可以损伤血管内皮细胞并降低连接完整性，促进溶栓治疗后MMP-9诱导的血管破裂。综上，MMP-9可以预测出血转化发生风险，有助于评价溶栓治疗安全性，与MMPs抑制剂的联合使用可在一定程度上减少出血转化并改善预后。

2.4 MMP-9与基质金属蛋白酶组织抑制因子

基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）可与 MMPs结合并抑制其活性。目前已发现的TIMP家族成员包含TIMP-1～TIMP-4，每种TIMP以非特异的方式与MMPs进行1∶1结合，形成TIMP-MMP复合物，通过与MMP活性位点的Zn2+相互作用激活其水解过程。4种TIMP对MMP-9均有抑制作用，其中TIMP-1的作用尤为显著。采用TIMP-1过表达转基因鼠制作脑缺血模型，其MMP-9水平显著低于野生型小鼠，BBB损伤及梗塞程度均减轻；反之，采用TIMP-1敲除小鼠制作脑缺血模型，可以引起MMP-9活性增加，进而加重组织损伤[29]。TIMPs/MMPs表达平衡还与缺血损伤程度及并发症发生风险有关。采用小鼠大脑中动脉梗塞再灌注及rt-PA溶栓模型发现，在脑缺血后不同时段，TIMPs与MMPs蛋白表达谱发生变化，而rt-PA的使用可以导致TIMPs/MMPs含量失衡[30]。TIMPs作为MMPs的内源性抑制剂，具有一定的脑保护作用，可以为新药研发提供重要思路。

3 治疗

目前，已经有较多研究探讨了抑制MMPs以减轻脑组织损伤的治疗方法，如MMPs抑制剂SB-3CT、BB-1101、Ro28-2653等。SB-3CT是一种竞争性MMP-2和MMP-9的双重抑制剂，可减轻局灶性缺血性脑损伤。BB-1101是一种广谱MMPs抑制剂，可以在减轻DNA氧化损伤的同时，保护BBB的紧密连接，防治出血转化并发症。Ro28-2653是一种新型广谱MMPs抑制剂，可以在脑缺血48 h显著减轻脑损伤[5]。除了MMPs抑制剂，物理疗法（无创性迷走神经刺激、常压高氧治疗、局部低温治疗等）、临床药物（如去甲斑蝥素、米诺环素、黄体酮等）、化合物（L-902、前列腺素EP4受体激动剂688、尼克酰胺单核苷酸等）以及中药提取物都有一定的MMPs抑制作用，羟肟酯类抑制剂、非羟肟酸盐抑制剂以及针对结合位点的药物和免疫治疗也已取得了进展[31]。深入认识MMPs在脑缺血损伤机制中的作用，有助于研发新的神经保护策略，为探索更安全、有效的治疗方法奠定基础。