RP-HPLC法测定滇金银花中绿原酸的含量

马跃新，聂根宇,李维莉*

(1．昆明市食品药品检验所 药品检验中心，云南 昆明 650032；2.昆明学院 化学化工学院，云南 昆明 650214)

滇金银花(FloraLoniceraebournei)为忍冬科植物西南忍冬(LonicereibourneiHemsl.)的干燥花蕾或带初开的花，在云南常作为药用金银花的地方习用品，收载于2005年版《云南省中药饮片标准：第7册》．该药材在《全国中草药汇编》中称为“短唇忍冬”，在《云南中药资源名录》中称为“西南忍冬”，为了与2015年版《中华人民共和国药典：一部》[1]收载的“金银花”区别，将该药材名称确定为“滇金银花”．滇金银花主要产于云南省的峨山、双柏、建水、思茅、勐腊等地．2005年版《云南省中药材标准：第7册》[2]显示，滇金银花中主要含有绿原酸等酚性成分、木犀草素和金丝桃苷等黄酮成分，以及三萜皂苷、挥发油等．目前，使用高效液相色谱法测定金银花中绿原酸的含量已有许多报道[3-6]，但对滇金银花含量测定的报道却较少．因此，本研究尝试建立反相高效液相色谱法测定滇金银花中绿原酸含量的方法，以期为评价滇金银花的质量提供科学依据．

1 材料与方法

1.1 药材

滇金银花3批(批号：160901；170802；161101)，经检验均为滇金银花．

1.2 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，带紫外检测器(美国安捷伦公司)；MS205DU电子天平(梅特勒公司，1/100 000)，AL204电子天平(梅特勒公司，1/10 000)；DFY-200高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；KQ 5200DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；CHORUS超纯水系统(英国ELGA公司)．

1.3 试药与试剂

绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110753-201716)；乙腈(德国默克集团，批号：JA054230，色谱纯)；磷酸(四川西陇化工有限公司，批号：170512，分析纯)；甲醇(国药集团化学试剂有限公司，批号：20170712，分析纯)；水为GB/T 6682中规定的一级水．

1.4 实验方法

1.4.1 对照品储备溶液的制备

精密称取绿原酸 25.00 mg，置 50 mL 棕色容量瓶，加50%甲醇制成每 1 mL 含 500 μg 的溶液，即得对照品储备溶液．

1.4.2 供试品溶液的制备

取过4号筛的该药材粉末 0.5 g，精密称定其质量，平行取样2份，准确加入50%甲醇溶液 100 mL，称定质量，超声处理 30 min，放置至室温，称定质量，用50%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，过滤，准确吸取续滤液 5 mL，置于 25 mL 的棕色量瓶，加50%甲醇溶液至刻度，摇匀，即得供试品溶液．

1.4.3 液相条件

色谱柱为Zorbax C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外检测器，检测波长 327 nm，流动相为V(乙腈)∶V(0.4%磷酸溶液)=10∶90，流速 1.0 mL/min，柱温 40 ℃，进样量 10 μL．对照品溶液色谱图如图1，供试品溶液色谱图如图2．

图1 对照品色谱图

图2 供试品色谱图

2 结果与分析

2.1 系统适用性考察

将制备好的供试品溶液与对照品溶液按1.4.3项下条件注入液相色谱仪进行系统适用性考察，结果理论板数均大于 8 000，供试品中主色谱峰绿原酸与前后杂峰的分离度均大于3.0．

2.2 线性关系考察

分别取1.4.1项下制备的对照品储备溶液0.00，1.00，2.00，4.00，8.00，20.00 mL 至 100 mL 量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀即得质量浓度为0.00，5.00，10.00，20.00，40.00，100.00 μg/mL 系列标准溶液．按1.4.3项下条件进样，然后以峰面积A为纵坐标，以绿原酸含量C为横坐标，绘制标准曲线图(图3)，回归方程为A=14.583 83C+4.978 55，R=0.999 90．

2.3 检出限及定量限考察

2.3.1 仪器检出限和定量限考察

取对照品溶液(质量浓度 5.00 μg/mL)分别稀释至信号/噪音比为S/N=1∶3和S/N=1∶10时，通过计算得到仪器所对应的检出限为 0.051 7 μg/mL，定量限为 0.164 μg/mL．

图3 绿原酸标准曲线

2.3.2 方法检出限和定量限考察

取供试品溶液(批号160901)分别稀释至信号/噪音比为为1∶3和1∶10时，计算得到方法检出限为 0.053 8 μg/mL，定量限为 0.182 μg/mL．

2.4 重复性实验

取滇金银花(批号160901)，按样品制备条件1.4.2制备的供试品溶液，平行制备6份，代入标准曲线得到供试品质量浓度，供试品中绿原酸的RSD为0.09%，结果见表1．

表1 重复性实验结果

由上述实验得出RSD小于2.0%，说明该方法的重复性良好．

2.5 精密度考察

系列标准溶液与对照品溶液4(即质量浓度 40 μg/mL)，连续进样6次，测定，代入标准曲线得到供试品质量浓度，计算得到RSD为0.07%，结果见表2．

表2 精密度实验结果

由上述实验得出RSD小于2.0%，说明该实验有较好的精密度．

2.6 稳定性实验

2.6.1 时间稳定性考察

系列标准溶液与供试品溶液(批号160901)分别在0，12，24，48，72，96 h 进样分析，以所得标准曲线计算质量浓度，并计算平均质量浓度与RSD，得到供试品中绿原酸的RSD为1.1%，结果见表3．

由上述实验得出RSD小于2.0%，说明供试品溶液在 96 h 内稳定．

2.6.2 柱温稳定性考察

系列标准溶液与供试品溶液(批号160901)分别在柱温为20，30，40 ℃ 进样分析，每次平行进样4次，以所得标准曲线计算所得质量浓度，并计算平均质量浓度和RSD，得到供试品中绿原酸的RSD为1.2%，结果见表4．

表3 时间稳定性实验结果

表4 柱温稳定性实验结果

由上述实验得出RSD小于2.0%，说明供试品溶液测定柱温在20～40 ℃ 的测定结果稳定．

2.7 回收率实验

精密称取1份已知含量的滇金银花粉末样品 0.50 g，加入适量绿原酸对照品，按样品制备方法操作，制成含对照品 25 μg/mL 的加标溶液，进行分析，结果代入标准曲线计算质量浓度，依次计算回收率．使用样品(批号160901)制备加标溶液6份，同时平行制备样品溶液．得到平均回收率为101.1%，RSD为0.3%，结果见表5．

2.8 样品含量测定

精密称取每批滇金银花粉末样品各两份，每份 0.5 g，按样品制备方法分别制备供试品溶液，每份进样测定2次，计算样品的平均含量，结果见表6．

表5 回收率实验结果

表6 样品含量测定结果

3 讨论与结论

因绿原酸分子结构中含有邻二酚羟基，遇光很不稳定，考虑到该因素，绿原酸对照品溶液及供试品溶液用棕色的容量瓶盛放，以保证测定结果的准确性与稳定性．

本实验对提取溶剂选择时，比较了乙醇、甲醇、50%乙醇溶液和50%甲醇溶液，最后选择峰形和提取率更好的50%甲醇溶液．

在绿原酸含量测定的过程中，对供试品溶液的制备方法进行比较，最终选取最佳方案为加入50%的甲醇溶液进行超声处理(功率 250 W，频率 35 kHz)30 min．对流动相和检测波长的选择，经比较认为以V(乙腈)∶V(0.4%磷酸溶液)=10∶90为流动相峰形及分离度效果最好，检测波长在 327 nm 处各色谱峰之间分离效果最佳．

在系统适用性实验中，通过在不同品牌液相色谱系统(赛默飞世尔液相、岛津液相)条件下测定绿原酸的理论塔板数与分离度，所得结果理论塔板数均大于 8 000，分离度均大于1.5，满足文献[1]中的标准要求．

样品的生长环境、采收时间、储存条件等因素均可能影响到滇金银花中绿原酸的含量，这可能是造成表6中样品含量差异较大的原因之一．

本实验结果表明，重复性RSD为0.09%，精密度RSD为0.07%，回收率RSD为0.3%，说明采用反相高效液相色谱法测定滇金银花中主要成分绿原酸的含量，方法操作简单、稳定、精确，可为评价滇金银花的质量提供参考依据．