不育男性抗苗勒管激素与生殖激素及精液质量参数关系的研究

陈伟文，杨龙，吴荣海，黄黎明，陈振翅，黄昌平，徐炜，廖勇彬*

(江门市中心医院1.泌尿外科；2.检验科；3.生殖中心，江门 529030)

男性不育症是一种发病率较高的男科疑难疾病。全球约5%～35%的家庭存在不孕不育问题，其中男方因素约占30%[1]。因此，必须加强男性不育的基础及临床研究。抗苗勒管激素(AMH) 是一种二聚体糖蛋白，由睾丸支持细胞分泌，以旁分泌作用于生精细胞，对生精细胞的成熟分化有着重要作用[2]。胎儿时期，AMH主要抑制苗勒管的发育并使中肾管发育为男性生殖管道[3-4]。目前AMH与性器官发育异常关系比较明确，与男性不育关系是近年研究的热点。因此，本研究探讨精浆和血清AMH与血清生殖激素及精液参数的关系，希望为精液异常所致的男性不育患者的治疗提供参考及帮助。

资料与方法

一、研究对象

选取2018年9～12月来我院生殖中心就诊和咨询的男性不育患者。常规询问患者病史，记录患者不育年限、身高、体重及睾丸总体积；行生殖系统体格检查，测定患者的精液参数，检测其精浆和血清中的AMH，同时检测血清FSH、LH、PRL、T及E2。纳入标准：(1)有规律性生活的男性不育患者；(2)男性性功能正常，可以手淫取精者；(3)对本研究知情同意，能积极配合研究。排除标准：(1)染色体异常、接触有毒、放射性物质患者；(2)既往有隐睾、睾丸扭转、睾丸肿瘤等手术史；(3)近3个月性激素或抗性激素治疗及全身或生殖系统感染患者；(4)患有影响生育的疾病(如尿道下裂、输精管异常、严重的精索静脉曲张、隐睾症、肿瘤等)。

本研究通过江门市中心医院伦理委员会同意批准，所有患者均签署知情同意书。

二、研究方法

1.样本采集：男性在禁欲3～7 d后，于上午(8：00 am～10：00 am)静脉抽血，血标本送检验科测定血清AMH、FSH、LH、PRL、T、E2。患者在舒适环境下使用手淫法采集精液，将精液射入干燥清洁广口器皿，立即送至生殖中心实验室。称重，37℃恒温箱中充分液化，然后进行精液常规及精子质量相关参数分析。用一次性吸头吸取1.5 ml精液，置于7 000 r/min离心机中离心3 min，取上层清液至干洁容器后进行精浆激素AMH测定。

2.激素检测方法：血清和精浆AMH采用AMH试剂盒(批号30151601，罗氏，美国),通过罗氏Cobas e602分析仪电化学发光法检测；血清FSH、LH、PRL、T和E2采用西门子ADVIA centaur XP分析仪直接电化学发光法检测，试剂盒均购自西门子医学诊断产品(上海)有限公司。所有激素项目测定严格按照说明书操作，激素灵敏度、最大浓度、批内变异系数及批间变异系数详细见表1。

表1 激素检测灵敏度、最大浓度、批内变异系数及批间变异系数

3. 精液参数分析：精液常规利用Sperm Class Analyzer(SCA)运动能力和浓度检测模块进行图像采集和精液分析，参照《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册(第五版)》(以下简称《WHO-5》)判断检测结果，每一份标本观察10个视野。主要包括精子浓度、前向运动精子(PR)百分比(%)等。精子形态分析根据《WHO-5》形态学严格判读标准及操作程序，采用改良的巴氏染色方法，每次计数200条以上精子，计算精子正常形态率，读片采用人工分析(技师已参加新版手册专业培训)；顶体酶采用WHO推荐的改良Kennedy法测定；精子DNA完整性采用吖啶橙染色法。检测试剂盒均购自深圳华康生物医学工程有限公司。

4.分组：参照《WHO-5》标准，根据精液参数分为4组：少精子症组(n=15)：精子浓度<15×106/ml，PR>32%；弱精子症组(n=26)：精子浓度>15×106/ml，PR<32%；少弱精子组(n=31)：精子浓度<15×106/ml，PR<32%；正常精子组(n=35)：精子浓度>15×106/ml，PR>32%。

三、统计学分析

结 果

一、一般情况比较

共纳入男性不育患者107例，年龄22～45岁。各组患者间年龄、禁欲天数、精液体积、不育年限、体重指数(BMI)、睾丸总体积等差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 一般情况比较(-±s)

二、血清生殖激素水平比较

单因素方差分析显示，不同组间血清FSH和T水平存在显著性差异(P<0.05)，LH、PRL及E2水平则均无显著性差异(P>0.05)。LSD法进行多重比较提示，少弱精子组血清FSH水平显著高于弱精子症组、正常精子组(P<0.05)，而与少精子症组无显著性差异(P>0.05)，少精子症组、弱精子症组和正常精子组两两比较无显著性差异(P>0.05)；正常精子组血清T水平显著高于少精子症组、弱精子症组和少弱精子组(P<0.05)，少精子症组、弱精子症组和少弱精子组两两比较无显著性差异(P>0.05)(表3)。

三、血清和精浆AMH的结果分析比较

Kruskal-Wallis多重检验显示，精浆AMH水平组间差异显著(P<0.05)，血清AMH水平则无显著性差异(P>0.05)。正常精子组精浆AMH水平显著高于少精子症组、少弱精子组(P<0.05)，但与弱精子症组无显著性差异(P>0.05)，少精子症组、弱精子症组和少弱精子组两两比较无显著性差异(P>0.05)(表4)。

表3 各组血清生殖激素水平比较[(-±s)]

注：采用单因素方差分析LSD法多重比较提示组间差异显著，▲P<0.05；与少弱精子组比较*P<0.05；与正常精子组比较，#P<0.05

表4 各组血清和精浆AMH的比较[M(QR)]

注：采用Kruskal-Wallis多重检验进行组间多重比较，▲P<0.05；与正常精子组比较，*P<0.05

四、精浆AMH、血清AMH与血清生殖激素的相关性分析

相关性分析显示，血清AMH与精浆AMH无相关性(P>0.05)，与血清FSH、LH、PRL、T、E2亦无相关性(P>0.05)；精浆AMH与血清FSH、LH呈负相关(P<0.05)，与血清T呈正相关(P<0.05)，与血清PRL、E2不相关(P>0.05)(表5)。

五、精浆AMH、血清AMH与精液参数的相关性分析

相关性分析显示，血清AMH与精液参数无相关性(P>0.05)；精浆AMH与精子浓度、精子总数、PR呈正相关(P<0.05)，与精液体积、正常精子形态率、顶体酶活性及精子DNA完整性不相关(P>0.05)(表6)。

表5 精浆AMH、血清AMH与血清生殖激素的相关性分析

注：Spearman相关性分析，*P<0.05

表6 精浆AMH、血清AMH与精液参数的相关性分析

注：Spearman相关性分析，*P<0.05

讨 论

AMH能促进具有分化成输卵管、子宫和阴道上段潜能的男性胎儿苗勒氏管的退化[5]，是转化生长因子β(TGF-β)超家族成员之一。在男性胎儿的第8周，睾丸的未成熟支持细胞开始表达分泌AMH，在男性性腺发育及性分化有重要的作用[4]。在未见睾丸的新生儿中，它常常用于鉴别患儿是无睾丸还是隐睾[5-6]。出生后3～12个月的婴儿AMH处于最高水平[7]，这可能与支持细胞增殖活跃有关[8]；青春期前，由于睾丸支持细胞处于未成熟阶段，体内AMH保持较高水平，生精细胞停留在减数分裂前期。在青春期AMH下降到低水平并保持相对稳定，这可能是由于睾丸间质细胞进一步分化，开始大量分泌T，促进睾丸支持细胞成熟，使生精细胞进入减少分裂，这时T对AMH的抑制大于FSH对其促进作用，最终导致AMH表达迅速下调至婴儿期的3%左右[7，9]。青春期后成年阶段AMH维持在较低水平[10]。生育期AMH水平随年龄的增长而下降[11]。

精子发生是一个激素依赖连续不断增生和分化的过程，主要通过下丘脑-垂体-性腺轴实现。LH作用于睾丸间质细胞(Leydig cells，LCs)，促进T的合成。FSH与睾丸支持细胞(Sertoli Cell，SCs)的FSH受体结合，与T共同调节精子的发生[12]。本研究显示FSH与精浆AMH水平呈负相关，这可能在转录因子SOX9、SF1、GATA4以及NF-κB和AP2的作用下，FSH参与激活Gsα蛋白，影响腺苷酸环化酶和蛋白激酶A(PKA)活性进而影响AMH水平[13-15]。本研究发现精浆AMH与LH呈负相关，因为AMH可刺激LH脉冲分泌，AMH变动可引起LH变动[16]，也可能通过下丘脑-垂体-性腺轴引起LCs功能失常，导致T生成异常，最终不利于精子发生。本研究观察到精浆AMH水平与血清T呈正相关，这可能是因为血清AMH通过下丘脑中AMH受体的作用，参与到下丘脑-垂体-性腺轴的调节[16]，而睾丸局部的AMH通过LCs上的AMH受体对其发挥一定的作用，影响到T的分泌，而T是维持精子发生所必需，通过细胞内雄激素受体(Androgen receptor，AR)介导精子发生过程，在没有T或缺乏功能性AR的环境下，精子发生减少，故AMH可通过影响T水平引起生精障碍。因此，AMH可激活Smad信号通路影响促性腺激素分泌，通过内分泌激素相互作用最终影响生精过程。

SCs产生AMH并能够双向分泌AMH，顶端向生精小管管腔分泌，向基底分泌则进入组织或血液循环，青春期后优先向顶端分泌[9]。由于血睾屏障的存在，使得AMH等大分子物质难以透过屏障而进入血液循环。所以，男性血清AMH与精浆AMH不存在相关性，血清AMH不能很好地预测精子发生[17]，与精子质量参数无相关关系(P>0.01)[17-19]，本研究也得出类似结果。此外，进入循环的AMH又受到全身性血浆的稀释作用。所以，精子发生过程中精浆AMH水平要明显高于血浆AMH水平[9]。睾丸组织产生的激素随着精液，通过射精由生殖道排出体外，其检测便捷且无创伤。所以探究精浆激素水平，比血清能更好地反映睾丸组织微环境中真实的激素水平状态，能更好地了解睾丸的生精状况，对患者诊治有着重要意义。

Andersen等[19]对94名来自普通人群的志愿者和32名不育男性进行研究发现，精浆AMH与精子浓度、精子总数及PR精子百分率存在相关性(P<0.01)。本研究中，正常精子组的精浆AMH浓度显著高于少精子症组和少弱精子组，且差异有统计学意义(P<0.05)；相关性分析发现精浆AMH与精子总数、精子浓度及前向运动呈正相关；与以往报道[17-19]结果相近。Majumdar等[20]通过小鼠实验发现，AMH对胚胎期及出生后小鼠精原细胞的发育有着重要作用。AMH可作用于SCs，并使其产生干细胞因子(stem cell factor，SCF)，而SCF又是SCs发育的重要调节因子。SCF通过激活PI3K信号转导途径，进而调节精原细胞的自我更新、增殖和分化。不同浓度的AMH对SCs产生不同效果。Anttonen等[21]使用不同浓度的rh-AMH去处理小鼠SCs，发现10～50 ng/ml低浓度的rh-AMH可通过激活细胞外信号调节激酶(extracellular-signal regulated kinase，ERK)信号转导途径，促使SCs的增殖；然而50～800 ng/ml高浓度的rh-AMH，通过干扰细胞凋亡信号转导通路，使凋亡基因Caspase-3等表达上调和抗凋亡基因Bcl-2表达下调，最终促进了SCs的凋亡。另外，Rehman等[22]也发现低浓度的rh-AMH能够激活丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族中非经典ERK信号传导路径，增加SCF mRNA和SCF蛋白表达水平。有研究以重组人FSH治疗特发性少弱畸精症，发现治疗有效患者的精浆AMH基线水平明显高于无效组，治疗后能提高患者AMH，暗示检测精浆AMH能预测患者的药物治疗效果[23]。此外Nery等[24]研究认为精浆AMH还有助于维持精子活力，可以作为评估弱精子症患者冷冻后复苏的精子质量指标之一。

因此，男性不育患者精浆AMH与部分精液参数存在一定的相关性。由于SCs在睾丸结构上起到支持、屏障作用，在功能上起到免疫豁免，以及在精子保护、排出、营养供给方面都起到重要作用，而AMH由SCs产生，并反作用于SCs。在适宜的浓度范围内，随着精浆AMH浓度的升高，精子浓度、PR%等精液参数会随它升高而提高。所以，检测精浆AMH能反映睾丸支持细胞数目及功能状况，一定程度上反映患者睾丸的生精功能。但是，本研究课题仅限于单一中心研究，且样本量较小、研究时间较短，需进一步扩大样本量、多中心、基础及临床研究，探讨精浆AMH与精子质量的关系以及AMH在精子发生中的作用，从而制定合适的医学参考值，指导男性不育诊治工作。