四引物扩增受阻突变体系PCR 技术及其在动植物遗传育种研究中的应用

余钧剑 迟美丽 贾永义 刘士力 竺俊全 顾志敏

（1. 宁波大学海洋学院，宁波 315211；2. 浙江省淡水水产研究所，湖州 313001）

单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是指DNA 序列中单个碱基的变化，包括碱基的转换、颠换、插入和缺失［1］，是继限制性片段长度多态性（RFLP）和简单重复序列（SSR）后的第3 代分子标记。SNP 标记具有突变位点数目多、遗传稳定性高、有利于实现高通量检测等优点［2］，因此被广泛应用遗传育种领域［1-3］。目前 SNP 的检测方法大致可以分为两大类：一大类是以单链构象多态性（SSCP）、变性梯度凝胶电泳（DDGE）、酶切扩增多态性序列（CAPS）、等位基因特异性 PCR（AS-PCR）等为代表的以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法；另一大类是以直接测序、DNA 芯片、变性高效液相色谱（DHPLC）、质谱检测技术、高分辨率熔解曲线（HRM）等为代表的高通量、自动化程度较高的检测方法［4-5］。总体上，前者传统的检测方法对设备要求不高，投入成本低，但速度慢，很难实现高通量的 SNP 检测；而后者的检测方法能实现 SNP 高通量、自动化检测，但对设备和技术要求高，成本很高。四引物扩增受阻突变体系PCR 技术是一种基于TaqDNA 聚合酶对位于引物3′末端碱基错配无法修复，在普通PCR 基础上，通过设计4个特异性的引物和优化扩增条件，实现对SNP 位点单管PCR 分型的检测技术［6］，具有操作简便、快速、能对SNP 进行分型、以及费用低等优点。本文详细介绍了四引物扩增受阻突变体系PCR 的技术原理、优势、结果检测手段和反应体系改进方法，综述了该技术在遗传育种研究中的应用，为该技术在种质资源鉴定、分子标记辅助选择以及分子设计育种等领域中的推广应用提供理论基础。

1 Tetra-primer ARMS PCR 技术原理

四引物扩增受阻突变体系PCR 简称四引物扩增法［7］，又被称为两对交叉引物PCR（PCR with confronting two-pair primers，PCR-CTPP）［8］、 单 管双向等位基因专一性扩增（Single-tube bi-directional allele specific amplification，SB-ASA）［9］和双向PCR扩增特异等位基因（Bidirectional PCR amplification of specific alleles，Bi-PASA）［10］。该方法是Ye 等［7］在2001 年将Tetra-primer PCR 和ARMS 法结合，以单管PCR 反应为基础，用以检测DNA 中点突变的基因分型新方法。Tetra-primer ARMS PCR 是在等位基因特异性PCR（Allele specific PCR，AS-PCR）的基础上发展起来的［11］，因此其基本原理相类似：在PCR 反应起始过程中，如果引物3′末端碱基与模板链上碱基按照碱基互补配对的原则反向互补，则延伸反应能正常进行，PCR 产物中有该引物相对应的特异性扩增产物。反之，如果引物3′末端碱基发生错配，基于TaqDNA 聚合酶对位于引物3′末端碱基错配无法修复，延伸反应不能正常进行，新链延伸速度低于上述引物3′末端碱基与模板链互补配对的延伸反应［12］。当错配碱基数目达到一定程度，3′末端错配的碱基与模板链间的磷酸二酯键形成受阻，扩增反应无法发生，PCR 产物中没有该引物相对应的特异性扩增产物［13］。因此，可以根据PCR 结果能否得到特异长度的扩增条带，确定模板DNA 上是否具有与引物3′末端相应的突变。

Tetra-primer ARMS PCR 技术需要根据其具体SNP 位点设计4 条不同的引物，分别在SNP 位点两侧设计2 条内引物（正向内引物N1 和反向内引物N2），在SNP 位点上下游不同距离（一般200-500 bp）分别设计2 条外引物（正向外引物W1 和反向外引物W2）。特异性内引物N1 和N2 延伸方向相反，分别与SNP 位点的两个等位基因相对应，其中正向内引物N1 3′末端碱基与某一个的等位基因相同，反向内引物N2 3′末端碱基与另一个等位基因互补。在此PCR 反应体系中，正向外引物W1 和反向外引物W2 扩增包含突变位点的对照片段，正向外引物W1 和反向内引物N2 扩增一条代表野生型（或代表突变型）的特异性片段，正向内引物N1 和反向外引物W2 扩增另外一条代表突变型（或代表野生型）的特异性片段。特异性内引物用来检测突变是否发生，外引物不但作为阳性参照而且和特异性内引物分别配对有选择性地扩增突变型与野生型个体基因。通过特异性扩增产物片段的有无和长度大小，鉴定待测样本是否为野生型、突变型或杂合型［11，14］。

2 Tetra-primer ARMS PCR 技术与常见SNP检测方法的比较

Stephan 等［15］在类风湿性关节炎致病基因LTA多态性的研究中比较了限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RELP）技术、高分辨率熔解曲线（HRM）分析、Sanger 测序法和Tetra-primer ARMS PCR 四种检测SNP 的方法，发现它们检测结果一致。但是与PCR-RELP 技术相比，Tetra-primer ARMS PCR 不需要用特异性内切酶消化切割PCR 产物，可以在PCR 完成后直接进行下一步的电泳，简化了操作步骤，省去限制性内切酶所需的检测成本和消化时间，同时又避免酶切不完全所造成的假阳性结果。而且PCR-RELP 仅仅只能够检测出位于酶切位点的SNP，Tetra-primer ARMS PCR 却不受其限制。与HRM 相比，HRM 需通过饱和染料（如SYBRGreen、ResoLight、SYT09 等）对PCR 产物进行闭管检测分析，但是要求检测设备具有较高的升降温速率及温度均一性，若待检测的DNA 片段GC 含量过高或SNP 位点过于集中，则无法进行HRM 检测。Tetra-primer ARMS PCR 对设备硬件的要求低，只需常规PCR 仪和电泳设备就可以操作。Sanger 测序是检测SNP 位点最直接可靠的方法，具有较高的灵敏度［16］，但是检测费用较贵，操作繁琐。关于Tetra-primer ARMS PCR 技术与其他常见SNP 检测方法的比较，如ASPCR 对于某基因单个位点的检测至少需要双管反应才能进行SNP 分型，Tetra-primer ARMS PCR 将反应集中到一个体系内进行，由于利用了引物间对 DNA 模板的竞争性结合，所以提高了检测系统的灵敏度和特异性，同时简化实验操作步骤，进而节省一定时间和成本［7］。而Taqman 荧光探针法可以特异、快速、高效、自动化地实现SNP 分型，但是由于探针的高费用，导致检测成本较高。目前大量研究证明通过设计4 条特异性引物进行Tetra-primer ARMS PCR、电泳，在2-3 h 可以实现单管基因分型，检测结果也与直接测序一致［17-18］。

因此与常见SNP 检测技术相比，Tetra-primer ARMS PCR 操作简单快速、价格低廉，在具备常规PCR 条件的实验室都可以开展，易于推广。但是该技术也有其局限性，如引物设计要求高、对于扩增条件要求严格。因此如何设计SNP 位点特异性内引物和如何改进反应条件获得清晰条带，对该技术的应用非常重要。

3 Tetra-primer ARMS PCR 反应体系的改进方法

Tetra-primer ARMS PCR 引物设计是决定该技术检测灵敏度和准确性的关键，其次反应体系的优化也能提高PCR 反应的特异性，从而防止引物与靶DNA 配对时可能发生的错配延伸，出现假阳性条带。反应体系通常从内外引物浓度和比例、反应温度、靶DNA 浓度、TaqDNA 聚合酶的用量和种类以及Mg2+浓度等在几个方面进行改进。

3.1 引入错配碱基

除了内引物3′末端碱基必须落在突变的位置上，为提高扩增的特异性和灵敏度，还可以在靠近内引物3′端的位置人为地引入错配碱基，这样对于匹配者有一个错配，而对于非匹配者则存在两个错配，大大地减少了非特异扩增。一般来说，人为错配碱基多位于引物 3′端倒数第二或三位。特异性高低还取决于碱基的错配类型，如果 3′端是高度不稳定的错配（A/G、T/T 或C/T），则需要引入较弱的错配（C/A 或G/T）或不引入错配，反之亦然［19］。

3.2 内外引物浓度和比例

内外引物浓度和比例是优化Tetra-primer ARMS PCR 反应体系的重要方面。若引物浓度过高，会导致引物与模板的非特异性结合机率增大而出现假阳性；若浓度过低则扩增产物少条带不清晰。Tetraprimer ARMS PCR 反应4 个引物集中于一个体系内进行，引物间存在与DNA 模板的竞争性结合，需要调节内外引物比例提高检测的特异性扩增。Ye 等［7］认为内外引物浓度之比为10∶1 并结合Touchdown PCR 时的检测灵敏性最高。郑炜佳等［20］把内外引物控制在4∶1 时得到较满意的特异性条带。姜树朋等［17］发现在内外引物之比为 1∶2 时特异性最好。所以不同的反应体系内外引物浓度和比例不同，一般来说，适当增加内引物浓度比例，可以增加特异性扩增片段的扩增量，提高检测的灵敏度。另外，扩增片段较长的引物由于扩增效率较低，需要适当提高引物浓度。

3.3 退火温度

Tetra-primer ARMS PCR 反应中退火温度越高，引物与模板的碱基互补结合越严格，扩增特异性越好，但特异性产物的量将减少；反之退火温度越低对特异性引物与模板的结合就越有利，但过低的退火温度会使非特异性扩增增多，出现假阳性结果。实验中一般在一定温度范围内对反应体系进行优化，以确定最佳的退火温度［21-23］。

3.4 其他方法

热启动TaqDNA 聚合酶可以提高PCR 的分型效果。Alyethodi 等［24］发现使用热启动TaqDNA 聚合酶代替TaqDNA 聚合酶就能显著提高特异性扩增效率，反应更灵敏。王瑞恒等［25］比较了TaqDNA聚合酶、ExTaqDNA 聚合酶以及热启动ExTaqDNA聚合酶，发现热启动ExTaqDNA 聚合酶的扩增效果最好。TaqDNA 聚合酶的用量、靶DNA 浓度、Mg2+浓度以及dNTP 的浓度也会对扩增的灵敏度和特异性产生影响，可以设定若干不同浓度进行验证优化［26-28］。此外，采用Touchdown PCR 可以显著增加反应的特异性［29-30］。

4 Tetra-primer ARMS PCR 技术检测手段

最初，由于Tetra-primer ARMS PCR 扩增的两条特异性产物长度不同，实验者使用琼脂糖凝胶电泳来检测。近年来通过结合其他检测设备、对引物进行荧光标记等方法，Tetra-primer ARMS PCR 的检测手段也不断改进，操作步骤得以简化，灵敏度也越来越高。

4.1 Tetra-primer ARMS PCR结合琼脂糖凝胶电泳

在传统的 Tetra-primer ARMS PCR 中，扩增产物一般直接应用电泳来检测。Tetra-primer ARMS PCR反应中上游和下游引物到突变点距离不同，因此在电泳图谱中得到大小不同的特异性谱带。根据 3′末端特异性引物阻断类型和电泳图谱中谱带大小以及有无，可以直接判断个体的基因型。该方法具有简便快速、设备要求低及价格低廉等特点［26］，是该技术相对其他技术的优点所在。

4.2 Tetra-primer ARMS PCR结合毛细管电泳

Vannucchi 等［31］在2006 年首次将Tetra-primer ARMS PCR 与毛细管电泳结合，并且成功检测到酪氨酸激酶2（JAK2）基因的点突变。丁子轩等［32］在2018 年通过Tetra-primer ARMS PCR 结合毛细管电泳法对淋巴瘤患者 MYD88 基因 L265P 突变进行分型，在PCR 反应中，上游内引物和下游内引物的 5′端均用荧光基团修饰，将 PCR 产物经过处理后进行毛细管电泳，MYD88 基因野生型和突变型分别在不同碱基序列长度处出现特异性单峰峰图。该方法将突变位点检测灵敏度提高到约1%的突变比例，显著高于传统的直接测序法［31-34］。而且该方法通过设计长度和荧光波长不同的内引物，对多个基因突变位点进行扩增后混合上样进行毛细管电泳，能同时检测多个位点［35］，进一步减少检测时间和试剂成本，如段素霞等［36］建立改进的四引物扩增受阻突变体系PCR 检测方法，结合QIAxcel 毛细管电泳分析扩增产物长度，实现单管一次性检测叶酸代谢过程相关基因的4 个SNP 位点。

4.3 Tetra-primer ARMS PCR结合熔解曲线

除了以上电泳检测手段，熔解曲线法也被应用到Tetra-primer ARMS PCR 检测过程中来。Liu 等［37］将四引物扩增受阻突变体系PCR 和熔解曲线技术相结合，在临床实验室检测骨髓增生性肿瘤（MPNs）的分子标志基因JAK2 的V617F 突变，准确性为100%，分析灵敏度为1.25%。该方法要求将四引物扩增受阻突变体系PCR 扩增的产物按一定速率升温变性，同时监测荧光信号的变化，绘制熔解曲线。当存在突变时，就能得到不同的 PCR 产物，而不同片段长度的 PCR 产物，就会形成不同 Tm 值的熔解曲线。根据熔解曲线波峰的多少和扩增的特异性条带所代表的碱基种类，就可以准确区分野生型纯合子、杂合子和突变性纯合子。Baris 等［38］应用此方法成功检测出FV、PII、MTHFR 和FGFR3 基因中的常见突变，该方法不仅可以减少电泳检测方法繁琐的操作步骤，避免可能引起的污染，还具有低成本、高通量的优点。

关于SNP 的研究越来越受到人们关注，与之相对应的检测技术也得到了快速发展。传统的琼脂糖凝胶电泳检测手段设备要求低，一般分子生物学实验室的条件均可满足该实验要求，价格也较低廉，容易推广。而毛细管电泳和熔解曲线检测手段对设备和技术要求高，成本也较昂贵。与传统检测手段相比，Tetra-primer ARMS PCR 结合毛细管电泳大大提高检测突变位点的灵敏度，还可定量检测基因突变，准确性接近实时定量PCR，通过一次电泳可同时检测多个位点。Tetra-primer ARMS PCR 结合熔解曲线技术则进一步简化操作步骤，将Tetra-primer ARMS PCR 反应过程和结果检测集中同一PCR 管。因此，小规模、灵敏度要求低的SNP 测序，可采用传统的琼脂糖凝胶电泳检测手段，而毛细管电泳和熔解曲线检测手段更适合准确性高的高通量检测。

5 Tetra-primer ARMS PCR 技术在动植物遗传育种研究中的应用

5.1 构建遗传连锁图谱

遗传连锁图谱的构建是对基因组进行系统研究的基础，也是动植物遗传育种的依据。利用DNA 分子标记技术构建的遗传连锁图谱，标记控制重要经济性状的基因，再利用定位克隆技术克隆这些基因，通过分子标记辅助育种，结合常规育种方法对经济物种进行遗传改良，最终生产出优质高产抗逆的优良品种［39］。SNP 分子标记在基因组中非常丰富且突变率低，可用于构建高精度的遗传图谱［40］。张建勇［41］以中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）F1 家系为作图群体，利用Tetra-primer ARMS PCR 技术对转录组高通量测序预测的单核苷酸突变进行分型，构建了具有200 个SNP 位点标记的中国对虾父母本的遗传连锁图谱。张紫晋［42］设计38 对Tetra-primer ARMS PCR 引物对携带抗条锈病基因Yr41 的小麦抗病品种川农19（CN19）进行SNP 检测，绘制出Yr41 基因的精细连锁遗传图。因此，通过Tetra-primer ARMS PCR 技术检测和开发的SNP 分子标记具有较高的准确性，可满足遗传连锁图谱的构建要求。

5.2 辅助选育和分子标记开发

Tetra-primer ARMS PCR 技术已经在多个物种中进行过与生长性状相关研究。彭娜等［43］对中华鳖（Trionyx Sinensis）IGF2 基因中2 个SNP 位点进行分型，分型结果与生长性状的关联系分析结果表明2 个SNP 位点具有用作中华鳖生长性状分子标记辅助育种的潜力。Zhang 等［44］开发2 个与秦川肉牛（Bovine）ACADVL 基因相关的SNP 位点，该基因对秦川肉牛的胸宽、胸深和髋宽有显著影响，可以作为选择秦川肉牛中具有优良生长性状个体的DNA 标记。在水稻中，研究者结合四引物扩增受阻突变体PCR 的技术原理开发基因功能标记，可准确区分水稻高氮利用率NRT1.1B 基因的纯合显性、纯合隐性和杂合基因型，可广泛应用于水稻NRT1.1B 基因的资源鉴定和分子标记辅助选择育种［45］。在与繁殖性状相关SNP 研究中，管峰等［46］建立一种BMPR-IB基因的Tetre-primer ARMS PCR 检测方法，准确判断绵羊个体中这一控制多胎性状的主效基因的基因型。Ahlawat 等［47］通 过Tetre-primer ARMS PCR 成 功 对黑孟加拉山羊（Capra aegagrus hircus）Fec 基因中鉴定的3 个新SNP 进行了基因分型，确定该基因与黑孟加拉山羊生殖力相关。在与抗病性状相关SNP 研究中，研究员分别建立了苦瓜［48］、辣椒［49］、牛［50］等抗病基因的Tetra-primer ARMS PCR 检测方法。综上所述，Tetra-primer ARMS PCR 技术可以作为一种非常有力的工具应用于辅助选育，将极大推动动植物遗传育种进程。

5.3 品种鉴定

品种鉴定技术现已由传统表型鉴定发展到分子标记技术鉴定，SNP 分子标记的应用能够为品种鉴定提供准确、快速的检测渠道。田孟祥等［45］针对水稻S5 基因设计Tetra-primer ARMS PCR 引物，能很好地对水稻籼粳属性进行区分，为利用籼粳杂种优势的亲本有效选择和籼粳分化研究提供重要参考。朱二勇［51］利用Tetra-primer ARMS PCR 对BMPR-IB基因分型研究中，开发用于策勒黑羊、多浪羊、湖羊以及中国美利奴羊（新疆型）品种特异性鉴定的SNP 分子标记。姚姝等［52］通过开发水稻Pi-ta、Pi-b和Wx-mq 基因SNP 分子标记对水稻品种南粳46、南粳5055 和南粳9108 进行品种鉴定，并且成功进行多基因聚合育种，选育出水稻新品系南粳0051。

6 小结

作为第三代分子标记技术，SNP 以其多态性丰富、在基因组中分布密度大等优势，在遗传育种、物种亲缘关系鉴定、种质鉴定、种质资源保存与管理、基因库构建等研究领域具有广阔的应用前景和发展潜力。Tetra-primer ARMS PCR 技术作为一种操作简单快捷、准确性高、低成本的SNP 分型技术，应用前景广阔。目前，Tetra-primer ARMS PCR 技术的发展方向主要在于通过与其他检测技术结合，使得其可满足大规模样本检测的要求、具有更高的检测灵敏度和准确性等优势，同时进一步简化实验操作步骤，降低成本。随着SNP 分子标记技术的飞速发展和Tetra-primer ARMS PCR 技术的不断完善，该技术必将广泛应用于动植物遗传育种研究，为实验者提供一种简便且成本低廉的SNP 分型手段。