依托咪酯通过miR-146a调节TLR4通路对内毒素急性肺损伤小鼠炎症反应的保护作用研究

安 静 张 睿 刘晓乐

(河南省省立医院麻醉科，郑州 450000)

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)发病机制非常复杂，多数是由于机体处于创伤、严重感染、中毒、休克或吸入毒性气体等产生的急性的、进行性的低氧性呼吸功能衰竭，后期会引发多脏器功能障碍，甚至导致死亡。有报道称，ALI死亡率高达40%以上[1]。脂多糖诱导的急性肺损伤死亡率较高，而Toll样受体(Toll like receptors，TLRs)家族中的TLRs4是脂多糖的受体，它与先天性免疫系统关系密切。miR-146a隶属于miR-146家族，在天然免疫过程中发挥着负反馈调节的作用，能够调节多种炎性因子的表达，从而达到控制炎症的目的[2]。依托咪酯作为一种咪唑类衍生的非巴比妥类短效全身麻醉药，是临床上常用的麻醉性药物，它对肾上腺皮质功能有一定的抑制作用，而肾上腺皮质对机体的炎性反应有调节作用，依托咪酯通过对基因水平的调控，可以增强体内抗炎因子的基因转录和合成，抑制致炎因子的基因转录和合成，从而能有效降低手术患者体内的炎性因子水平。但是依托咪酯在麻醉过程中对患者体内炎性因子的影响机理尚不明确，本实验通过研究依托咪酯干预导致体内高表达miR-146a，从而调节TLR4通路达到控制内毒素急性肺损伤小鼠炎症反应的作用，并为ALI临床预防和治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1材料 LPS购自美国Sigma公司；依托咪酯(20 mg/10 ml国药准字：H32022992)购自江苏恩华；TNF-α、IL-6和 IL-1β检测试剂盒购自上海依科赛生物制品有限公司；超净工作台购自天津医药净化设备厂；梯度PCR仪购自德国Biometre公司；DU800核酸蛋白分析仪购自德国BECKMAN COULTER公司；BALB/c 小鼠 80只，雄性，12周，体重(20±2)g，由广东省实验动物中心提供，许可证号：scxk (粤)2008-0002；所有操作均符合《实验动物管理条例》。蛋白提取试剂购自北京索莱宝科技有限公司；一抗购自美国Abcam公司；Trizol Reagent购自大连TaKaRa生物技术公司；RNA逆转录试剂盒购自昆明倍捷科技有限公司；SYRB Real-time PCR 试剂盒购自上海吉玛制药技术有限公司；辣根标记羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗小鼠TLR4抗体购自美国Santa公司；DNA及蛋白maker、引物购自大连宝生物公司；Western blot检测设备购自北京新诺立华仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1实验动物模型制作与分组 SPF级别BALB/c雄性小鼠60只，随机分为空白对照组、模型组、依托咪酯组，每组20只。参照文献[3]对所有小鼠实验前禁食12 h，不禁水。模型组及药物干预组给予腹腔注射LPS，浓度2 mg/ml，约200 μl/只 (20 mg/kg)。空白对照组给予等体积生理盐水腹腔注射。注射LPS后，小鼠出现呼吸频率加快，活动力降低，拒绝饮水，寒战，无力逃避，毛发耸立，解稀水样便。

1.2.2实验动物给药方式 药物干预组于造模后0.5 h给予依托咪酯，依托咪酯剂量则根据人、小鼠等效剂量换算，换算后给药剂量为2.5 mg/kg。空白对照组及模型组给予等体积生理200 μl/只。

1.2.3标本采集及检测方法

1.2.3.1内毒素含量检测 于给药后6 h采用摘除眼球取血法，收集约0.5 ml血液，离心后留取富含血小板的血浆，应用动态浊度法-血浆内毒素检测试剂，将血浆加入到内毒素检品处理液中，应用LPS检测分析得出数据。

1.2.3.2RT-PCR检测miR-146a、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA在肺组织中的表达 根据Trizol法提取总RNA，将抽取的RNA取500 ng经逆转录成cDNA，以 cDNA产物为模板，用Real-time PCR法检测 miR-146a，MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表达。MyD88引物：上游：5′-GGACTGCCAGAAATACATACGC-3′；下游：5′-CTTTGTCTGTGGGACACTGCTC-3′；产物长度为94 bp，退火温度为52℃。IRAK1引物：上游：5′-GCTCCCAGACCCATTCTGAG-3′；下游：5′-CTCTGGGCTTGGCTT-GATGG-3′；产物长度为96 bp，退火温度为60℃。IRF5引物：上游：5′-ATGATTACGTTCTGGGAG-AAGA-3′；下游：5′-TCTTTGGGTAAGGAATAGGGTG-3′；产物长度为205 bp，退火温度为52℃。TRAF6引物：上游：5′-AAGTTGCCGAGATGGAAGC-3′；下游：5′-CCAGGGCTATGAATGACCAC-3′；产物长度为118 bp，退火温度为59℃。Real-time PCR 扩增条件为：95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 45 s，共 40个循环，实验重复3次。以miR-39、U6和GAPDH作为内参照。

1.2.3.3Western blot检测TLR4、MyD88、TRAF6、IRAK1、IRF5蛋白在肺组织中的表达 取实验小鼠肺组织经处理后离心提取总蛋白，用BCA法进行蛋白定量，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据目的蛋白分子量大小选取8%或10%的分离胶进行分离，取30 μg样本上样，进行彩染蛋白分子量指示SDS-聚丙烯酰胺凝胶，大小10 cm×10 cm，经80 V恒压分离30 min后调至120 V恒压，当蛋白指示剂移动至分离胶底部时再用300 mA恒流电旋转75 min，5%的脱脂牛奶室温封闭1 h。兔抗小鼠TLR4抗体、兔抗小鼠MyD88抗体、兔抗小鼠TRAF6抗体、兔抗小鼠IRAK1抗体、兔抗小鼠IRF5抗体4℃分离过夜，TBST洗涤3次，二抗孵育1 h后ECL显色，曝光拍照，Tannon Gis软件分析曝光底片光密度值。

2 结果

2.1各组小鼠一般情况 各组小鼠无中途脱落。空白对照组小鼠活动及进食及外界刺激反应正常。模型组及依托咪酯组小鼠在应用LPS后，出现呼吸频率加快、活动力下降，进食减少，对外界刺激反应差等，但两组比较，模型组症状明显较重，出现呼吸窘迫、寒战、拒绝食水。

2.2小鼠血清内毒素(ET)含量 空白对照组小鼠血清内毒素含量非常低，但模型组、依托咪酯组与空白对照组，血清内毒素含量明显升高，P<0.05，差异有统计学意义，说明造模成功，存在内毒素损伤。依托咪酯组与模型组比较，依托咪酯组小鼠血清内毒素含量下降，P<0.05，差异有统计学意义，表明依托咪酯具有减轻内毒素损伤的作用。具体见图1。

2.3BALF中TNF-α、IL-6 和 IL-1β的含量 空白对照组小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6 和IL-1β含量非常低，但模型组、依托咪酯组与空白对照组，TNF-α、IL-6和 IL-1β含量明显升高，P<0.05，差异有统计学意义，说明LPS诱导小鼠肺脏产生急性炎症反应，炎性细胞因子产生增多。与模型组比较，依托咪酯组TNF-α、IL-6和IL-1β含量下降，P<0.05，差异有统计学意义，表明依托咪酯具有减轻急性肺损伤炎症反应，降低炎性细胞因子作用。具体见图2。

2.4miR-146a、TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA在肺组织中的表达 空白对照组小鼠肺组织可以检测到一定水平的miR-146a表达。模型组、依托咪酯组小鼠肺组织中miR-146a表达水平较空白对照组明显升高，P<0.05，差异有统计学意义。与模型组比较，依托咪酯组miR-146a表达水平更高，P<0.05，差异有统计学意义。空白对照组小鼠肺组织中有少量的TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表达，但模型组、依托咪酯组与空白对照组比较，TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表达水平上调(P<0.05)，差异有统计学意义。与模型组比较，依托咪酯组TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表达水平下降(P<0.05)差异有统计学意义。具体见图3。

图1 小鼠血清内毒素含量(ELISA)Fig.1 ET concentration in blood serum(ELISA)Note:*.P<0.05 versus Control；△.P<0.05 versus LPS.

图2 肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量(ELISA)Fig.2 TNF-α,IL-6 and IL-1β concentration in bronchoalveolar lavage fluid(ELISA)Note:*.P<0.05 versus Control；△.P<0.05 versus LPS.

图3 肺组织中miR-146a、TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA的表达(RT-PCR)Fig.3 miR-146a,TLR4,MyD88,IRAK1,IRF5,TRAF6 relative expression in lung tissue of mice(versus LPS)Note:*.P<0.05 versus Control；△.P<0.05 verus LPS.

图4 肺组织中TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 蛋白的表达(WB)Fig.4 TLR4,MyD88,IRAK1,IRF5,TRAF6 protein expression in lung tissue of mice(WB)Note:*.P<0.05 versus Control；△.P<0.05 versus LPS.

图5 肺组织中TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 蛋白的表达(WB)Fig.5 TLR4,MyD88,IRAK1,IRF5,TRAF6 protein expression in lung tissue of mice(WB)

2.5TLR4、MyD88、TRAF6、IRAK1、IRF5蛋白在肺组织中的表达 空白对照组小鼠肺组织中有少量的TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 蛋白表达，但模型组、依托咪酯组与空白对照组比较，表达水平明显上调，P<0.05，差异有统计学意义。与模型组比较，依托咪酯组表达水平下降(P<0.05)，差异有统计学意义。具体见图4、5。

3 讨论

TLRs是人体先天免疫的重要组成部分，调控其表达可以促进附近脏器的炎症修复。TLR4作为TLRs家族中发现最早的受体之一，可以识别细菌中LPS，在内毒素耐受中发挥重要的作用。当正常细胞受到感染刺激时释放的LPS和CD14相结合，然后与TLR4聚合后活化使得信号转导到细胞内，活化后的TLR4与MyD88结合并活化，活化后的MyD88与IL-1受体相关激酶(IRAK)相结合，从而导致IRAK磷酸化，进而激发TNF受体相关因子-6(TRAF-6)释放，最终导致相关基因发生转录、翻译，从而导致炎性因子释放。如果能够影响细胞内外的TLR4水平来阻断TLR4传递LPS信号通路，可以有效抑制内毒素产生的炎症反应。miR-146是在免疫系统中发现具有调控作用microRNA，分为miR-146a和miR-146b两种，分别位于人类基因的第五号和第十号染色体上，在小鼠基因中位于第十一号和第十九号染色体上[4]。miR-146a和miR-146b仅有两个核酸序列不同，近年来对miR-146a研究较多，发现miR-146a与NF-κB通路相连，广泛参与了肿瘤、炎症等生命活动[5-7]。miR-146a作为一种炎症保护性因子可以在多个水平上调控TLR4信号通路，主要表现在：①miR-146a可以调控TLR4的表达；②miR-146a可以作用于TLR4中的信号通路分子，如IRAK1、IRF5、TRAF6，抑制其释放；③miR-146a作用于TLR信号通路调节基因，通过多条途径调控TLR4通路，从而抑制TLR4的促炎症通路[8-10]。

本研究中，通过LPS诱导建立急性肺损伤小鼠模型，并给予依托咪酯进行干预，发现依托咪酯组与模型组比较，依托咪酯组小鼠血清内毒素含量明显下降，表明依托咪酯具有减轻内毒素损伤的作用。通过对BALF中TNF-α、IL-6和 IL-1β的含量测定，发现模型组、依托咪酯组与空白对照组，TNF-α、IL-6和 IL-1β含量明显升高，说明LPS诱导小鼠肺脏产生急性炎症反应，炎性细胞因子产生增多。与模型组比较，依托咪酯组TNF-α、IL-6和IL-1β含量下降，表明依托咪酯具有减轻急性肺损伤炎症反应，降低炎性细胞因子作用。通过检测miR-146a、TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA在肺组织中的表达发现，空白对照组小鼠肺组织可以检测到一定水平的miR-146a表达；模型组、依托咪酯组小鼠肺组织中miR-146a表达水平较空白对照组明显升高，与模型组比较，依托咪酯组miR-146a表达水平更高，同时发现空白对照组小鼠肺组织中有少量的TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表达，但模型组、依托咪酯组与空白对照组比较，TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表达水平上调，与模型组比较，依托咪酯组TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表达水平下降。模型组、依托咪酯组与空白对照组比较TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 蛋白表达水平明显上调，与模型组比较，依托咪酯组TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6表达水平明显下降。综上研究发现，模型组炎症因子及TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA水平明显上调，提示ALI的发生于炎症因子及TLR4有关。和模型组相比，依托咪酯组可以明显提高miR-146a含量，同时依托咪酯组的炎症因子水平较模型组明显下降，TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6 mRNA表达水平较模型组明显下降，TLR4、MyD88、IRAK1、IRF5、TRAF6表达水平较模型组明显下降，说明依托咪酯能够通过提高miR-146a含量进而调节TLR4通路，抑制TLR4表达水平，对LPS诱导的MyD88、TRAF6等mRNA及蛋白的表达有明显的抑制作用。

本研究表明，依托咪酯可以提高炎症保护性因子miR-146a的含量，进而调节TLR4通路对内毒素急性肺损伤小鼠炎症反应的保护作用。但该研究结果有待更大样本动物实验的验证，具体的作用机制有待进一步研究。