富含亚麻酸的膳食亚麻籽油对2型糖尿病大鼠外周血和脾脏髓源抑制细胞及炎症因子的影响①

朱丽丽 张晓霞 王 振 薛 静 汪 婷 王 浩

(宁夏医科大学基础医学院，银川 750004)

糖尿病是公认的重大健康问题[1]，全球患病人数超过4.5亿[2]，严重威胁人类身体健康。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一种由遗传和环境多种因素共同引起的以胰岛素抵抗为主、同时伴有胰岛 β 细胞功能受损的内分泌疾病[3]。临床研究显示[4]，炎症因子如IL-6、IL-1β和TNF-α可激活一系列信号通路，诱发低度炎症反应，干扰正常胰岛素信号传导，引起胰岛素抵抗。其中炎症因子介导的慢性免疫炎症反应在T2DM发病机制中起着至关重要的作用[5]。

髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)是骨髓祖细胞和未成熟髓细胞组成的异质细胞群，是树突状细胞、粒细胞和巨噬细胞的前体。MDSCs在罹患癌症、炎症和感染期间增殖明显[6-8]，显著抑制T细胞反应[9-11]。目前，对MDSCs不仅局限于肿瘤的研究，在慢性炎症、病毒感染和自身免疫性疾病中的研究也日益增多[12]。

除临床干预外，膳食添加剂有望成为预防和缓解糖尿病的重要手段。而亚麻籽油(flxseed oil,FO)是目前ω-3 多不饱和脂肪酸含量最高的植物油脂之一[13]，含有丰富的亚麻酸(α-linolenic acid,ALA)，具有包括抗炎在内的多种生物学功能的优质食用油[14]。本课题组前期研究发现，FO可以通过降低小鼠血浆中TNF-α、IL-1β、IL-6水平及调节肠道菌群来改善酒精性肝病[15]。然而，FO对T2DM大鼠MDSCs及血浆炎症因子的影响尚不清楚。在该实验中为确保摄入能量一致，采用链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)和烟酰胺(nicotina-mide，NA)依次腹腔注射成功诱导T2DM模型[16]，并用流式细胞术检测外周血和脾脏中MDSCs比例变化，用ELISA测定血浆中炎症因子表达，用Pearson方法分析MDSCs和炎症因子的相关性，初步探索FO对T2DM的作用，为FO抗炎和实际开发应用提供更多理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 180～200 g雄性SD大鼠32只，由宁夏医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(宁)2015-0001。FO购自宁夏六盘珍坊生态农业科技有限公司，饲料由南通特罗菲饲料科技有限公司提供，血糖仪和试纸购自鱼跃公司。STZ和NA均购自Sigma公司。RPMI1640 培养基购自HyClone试剂公司。大鼠荧光抗体FITC-His48和PE-CD11b/c购自美国赛默飞世尔公司。IL-10、IL-1β和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)试剂盒购自江莱生物。大鼠外周血细胞分离试剂盒购自索莱宝公司。Cytoflex流式细胞仪是美国贝克曼库尔特有限公司产品，酶标仪是美国赛默飞世尔科技公司产品。

1.2方法

1.2.1实验分组、造模与给药 同一批次的SD雄性大鼠32只，适应性喂养1周后，随机分为正常组和造模组。造模方法如下，按参考文献[17,18]，大鼠禁食不禁水12 h后，以65 mg/kg剂量腹腔注射新鲜配制的STZ溶液(现用现配，避光冰上操作)，15 min后，腹腔注射110 mg/kg的 NA溶液，正常组腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲液和生理盐水，分别于注射后第3天和第7天，尾静脉取血检测空腹血糖，两次血糖值均≥11.1 mmol/L并伴有多饮、多食、多尿症状视为T2DM造模成功。随机从正常组和糖尿病组选取8只分别作为正常组(NC)、糖尿病组(T2DM)、亚麻籽油干预对照组(NC+FO)和亚麻籽油干预组(T2DM+FO)。NC组和T2DM组脂肪主要为10%w/w玉米油，NC+FO组和T2DM+FO组是亚麻籽油等量代替玉米油，确保能量相等。

1.2.2标本采集 亚麻籽油连续干预5周后，禁食过夜，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉采血后，将其置于含EDTA-2K抗凝管中，4℃ 2 000 r/min离心10 min，分离出血浆和血细胞。

1.2.3外周血单细胞悬液的制备 用等体积的PBS稀释大鼠新鲜血细胞，在离心管中加入和血细胞等体积的淋巴细胞分离液，将稀释后血细胞平铺于分离液上方，4℃ 2 000 r/min离心5 min后吸取白膜层，加入细胞清洗液洗涤白膜层细胞，4℃ 1 500 r/min 离心5 min后弃上清。然后加入适量红细胞裂解液，1 500 r/min离心5 min后，清洗细胞，弃上清。最后加入RPMI1640重悬细胞，调整细胞悬液浓度为2×106个/ml，供后续实验使用。

1.2.4脾脏单细胞悬液的制备 分离各组大鼠脾脏组织，将取出的脾脏放入培养皿中，加入适量RPMI1640后，分离研磨脾脏。300目滤膜过滤，4℃ 1 500 r/min离心5 min后弃上清，然后加入适量红细胞裂解液，4℃ 1 400 r/min离心8 min，弃上清，用RPMI1640清洗细胞一次，如红细胞过多，再裂解一次。RPMI1640重悬细胞，调整细胞悬液浓度为2×106个/ml，供后续实验使用。

1.2.5流式细胞仪检测MDSCs 吸取上述提取的细胞悬液各100 μl加入流式管中，分别加入1 μl 抗大鼠FITC标记的His48和PE标记的CD11b/c表面抗体，轻轻混匀，4℃避光孵育30 min后，每管加入1 ml 细胞染色缓冲液，4℃ 1 400 r/min离心5min清洗细胞，弃上清，重复洗涤细胞一次，然后用滤纸将流式管管口吸干，最后加入300 μl RPMI1640重悬细胞，立即上机检测。

1.2.6血浆中炎症因子的检测 IL-10、IL-1β和TNF-α按照江莱试剂盒说明书进行检测。

2 结果

2.1FO对T2DM大鼠外周血中MDSCs的影响 实验结果如图1所示，在NC、T2DM、NC+FO和T2DM+FO组中，外周血中MDSCs的比例分别为(3.54±1.31)%、(7.44±1.67)%、(4.41±1.32)%和(9.62±2.12)%。T2DM组大鼠外周血中MDSCs比例显著高于NC组(P<0.05)；与T2DM组比较，T2DM+FO组MDSCs比例显著升高(P<0.05)。上述结果表明，FO干预T2DM大鼠可增加外周血MDSCs水平。

2.2FO对T2DM大鼠脾脏细胞中MDSC的影响 实验结果如图2所示，在大鼠脾脏细胞中，NC、T2DM、NC+FO和T2DM+FO组中MDSCs的比例分别为(3.84±1.37)%、(6.35±1.50)%、(4.10±1.33)%和(9.11±3.49)%。T2DM组大鼠脾脏细胞中MDSCs比例显著高于NC组(P<0.05)；与T2DM组比较，T2DM+FO组脾脏中MDSCs比例显著升高(P<0.05)。以上结果说明，FO可明显增加T2DM大鼠脾脏细胞中MDSCs含量。

2.3FO对T2DM大鼠炎症因子表达水平的影响，与NC组比较，T2DM组大鼠血浆IL-1β和TNF-α表达水平显著升高(P<0.001)；FO干预后，血浆中IL-1β和TNF-α含量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。T2DM+CO组IL-10含量低于NC+CO组，FO干预后IL-10含量升高，但差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。

2.4各组大鼠血浆炎症因子与MDSCs相关性分析 大鼠外周血(MDSCs vs.IL-1β：r=-0.785 5,P=0.002 5;MDSC vs.TNF-α:r=-0.820 4,P=0.001 1)和脾脏(MDSCs vs.IL-1β：r=-0.822 8,P=0.001 0;MDSCs vs.TNF-α:r=-0.809 5,P=0.001 4)中MDSCs含量和大鼠血浆中IL-1β、TNF-α呈负相关(图4)。

图1 流式细胞术检测FO对T2DM大鼠外周血MDSCs比例的影响Fig.1 Flow cytometry analysis of percentage of MDSCs from peripheral blood in T2DM rats after FO interventionNote:*.P<0.05.

图2 流式细胞术检测FO对T2DM大鼠脾脏细胞中MDSCs比例的影响Fig.2 Flow cytometry analysis of percentage of MDSCs from spleen in T2DM rats after FO interventionNote:*.P<0.05.

图3 ELISA检测各组大鼠血浆IL-1β、TNF-α和IL-10水平Fig.3 ELISA analysis levels of plasma IL-1β,TNF-α and IL-10 in different groupsNote:*.P<0.05,***.P<0.001.

图4 炎症因子与外周血及脾脏中MDSCs相关性分析Fig.4 Correlation between inflammatory cytokines and MDSCs of peripheral blood and spleenNote:A，B.Correlation analysis between IL-1β and MDSCs in peripheral blood and spleen;C，D.Correlation between TNF-α and MDSCs in peripheral blood and spleen.

3 讨论

T2DM属于一种慢性低度炎症状态，TNF-α、IL-1β和 IL-6等促炎因子升高，抗炎因子IL-10降低[19,20]，炎症因子通过调节免疫系统，从而参与T2DM的发生发展[21]。近年来研究显示，T2DM的进展与慢性低度炎症密切相关[22-26]。FO作为一种优质的食用油，富含ω-3 多不饱和脂肪酸，可阻断 NF-κB 信号通路，抑制多种炎症因子的表达，降低炎症反应[27,28]。除此之外，FO还具有抗动脉粥样硬化、降血糖、降血压、降血脂等多种作用[14,29]。

MDSCs是骨髓来源的具有免疫抑制作用的一群异质性细胞，主要包括：未成熟粒细胞、单核细胞、骨髓前体细胞和树突样细胞，在感染、炎症及肿瘤中MDSCs的数量显著增加[30,31]。有研究显示，MDSCs可以抑制促炎因子IL-1β和TNF-α的生成，促进抗炎因子IL-10的产生，发挥抑制炎症作用[32]。最近有研究发现，在T2DM患者外周血和脾脏细胞中，MDSCs比例显著增加，延缓了疾病的发生发展[33]。Yin等[34]通过动物模型研究证实，在MDSCs移植到T2DM小鼠体内后，发现转移的MDSCs具有降低血糖和预防糖尿病发作的能力。目前为止尚未确定大鼠MDSC分子标志，CD11b/c、His48是当前研究中报道最多的谱系标志[35,36]，故本研究采用其作为检测标志分子。

在本研究中，通过流式细胞术分析发现，T2DM组大鼠外周血和脾脏细胞中MDSCs比例明显高于NC组；而相对于T2DM组，T2DM+FO组外周血和脾脏细胞中MDSCs比例也显著增加，说明FO能够使MDSCs在外周血和脾脏中大量增殖，抑制其向成熟的髓系细胞分化，从而发挥负向免疫调控的作用[37,38]。通过ELISA检测大鼠血浆中细胞因子，发现T2DM组血浆炎症因子IL-1β和TNF-α水平显著高于NC组，此结果提示T2DM大鼠炎症因子的表达升高，与之前的研究结果一致[19,20]，这可能和胰岛素抵抗有关[39]。在FO干预后，T2DM+FO组IL-1β和TNF-α水平明显降低，说明FO可有效改善T2DM的炎症反应，可能与ALA激活GPR120和抑制TLR4下游信号通路有关[40,41]，为此我们将在接下来开展相关深入研究。在本研究中，抗炎因子IL-10在T2DM组减少，在T2DM+FO组增加，但是差异没有统计学意义。分析外周血和脾脏细胞中MDSCs含量与血浆中IL-1β和TNF-α的相关性，发现MDSCs与炎症因子IL-1β和TNF-α呈负相关，可能和MDSCs抑制炎症因子的表达有关[10]。

综上所述，FO可诱导T2DM大鼠的MDSCs在外周血和脾脏细胞中募集，并且降低血浆中炎症因子IL-1β和TNF-α的含量，延缓T2DM的进展，可为T2DM的免疫抑制治疗提供新的思路。而且FO作为一种优质食用油，安全实惠，提示其对T2DM的辅助治疗具有良好应用前景。