谷氨酰胺对灌服大豆分离蛋白仔猪肝脏和肌肉抗氧化功能的影响

■彭 梦 王惠云 李诚诚 赵 迪 王 蕾 吴 涛 丁斌鹰 易 丹

（动物营养与饲料科学湖北省重点实验室 武汉轻工大学动物科学与营养工程学院，湖北武汉430023）

蛋白质是动物饲料的重要组成部分，高质量的饲料蛋白质会促进动物机体的生长和健康[1]。动物性蛋白是最常见的高蛋白质来源之一，但考虑到饲养成本，在饲料过程中通常都是添加植物性蛋白质（如大豆蛋白）。大豆分离蛋白（Soy Protein Isolate，SPI）具有氨基酸种类有近20 种，并含有人体必需氨基酸。其营养丰富，不含胆固醇，是植物蛋白中为数不多的可替代动物蛋白的品种之一[2]，是一种组分复杂、蛋白质含量不低于90%的大豆蛋白混合物[3]。大豆分离蛋白中含有许多大豆抗原蛋白，大豆抗原蛋白是指大豆及其制品中可引起人畜禽产生过敏反应的一些大分子蛋白质或糖蛋白[4]，会影响营养物质的消化吸收，容易引起人和幼龄动物的大豆过敏反应，造成不良的生理反应[5]。大量的研究表明，大豆抗原蛋白会导致仔猪产生过敏反应[6]，使仔猪肠道形态结构发生改变[7]、产生腹泻[8]、生长受阻[9]等负面影响。而大豆抗原蛋白对仔猪抗氧化以及肝脏形态结构方面的研究资料较少。功能性氨基酸如谷氨酰胺（glutamine，Gln）是体内含量最丰富的游离氨基酸，它不仅是组织间氮运输载体、核苷酸和其它氨基酸合成前体[10]，还是快速分化细胞的主要能源物质[11]。而早期断奶仔猪遭受来自各方面的应激且丧失母源Gln时，由于其体内尚不能合成足够的Gln 供机体需要，组织结构和功能会发生变化。而外源添加Gln 可缓解肠组织结构变化[12]。动物试验表明，Gln 能通过增加谷胱甘肽的生物合成及其在肝脏的贮存来保护肝脏功能[13]。本试验旨在探究营养素Gln 对灌服大豆分离蛋白仔猪抗氧化功能以及肝脏形态结构的影响，为谷氨酰胺在早期断奶仔猪生产中的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

谷氨酰胺（Gln）：购自Sigma公司，货号G3126；L-丙氨酸（L-Alanine，Ala）：购自MACKLIN（麦克林）公司，货号A6198；酪蛋白（Casein）：购自Sigma 公司，货号C7078；大豆分离蛋白（SPI）：购自MACKLIN（麦克林）公司，货号S832685。

1.2 试验动物与试验设计

24头7日龄仔猪随机分为3个组：对照组、SPI 组和SPI+Gln组。每个组8个重复，每个重复1头猪。试验1～5 d，所有仔猪饲喂人工乳。试验第6～7 d，对照组灌服7.8 g/kg BW酪蛋白，其它2组均灌服10 g/kg BW大豆分离蛋白（粗蛋白含量为78%），灌服2 d。试验第8～10 d，SPI+Gln 组灌服250 mg/kg BW 的Gln，Gln剂量根据研究文献Wang 等[14]确定。对照组和SPI 组仔猪均灌服305 mg/kg BW 的丙氨酸，以保证各组等氮平衡。

1.3 基础日粮

试验基础日粮为人工乳，购自武汉安佑饲料有限公司。

1.4 饲养管理

饲养期间需保持良好的通风环境，室温维持在28～30 ℃；各猪栏舍配备保温灯和不锈钢料盘；每天早晚各清扫并消毒猪舍一次。每天在8:00、12:00、15:00、18:00与21:00按照温白开水∶奶粉=4∶1的比例冲泡人工乳，水温控制在45～55 ℃，并于8:00、12:00与21:00增喂一次水。

1.5 样品采集

试验猪屠宰后迅速取出肝脏，去除胆囊，在肝脏中切取0.5 cm3的组织块，用冷生理盐水冲洗肝脏2～3 次，放入40%的多聚甲醛溶液中固定。经石蜡包埋、苏木素-伊红（H.E）染色后制成肝脏病理切片。此外，将肝脏组织、腓肠肌、背最长肌剪成小块包于锡箔纸中置于液氮中速冻，后转入-80 ℃冰箱中保存待测。

1.6 检测指标与方法

使用南京建成生物工程研究所试剂盒检测肝脏、腓肠肌和背最长肌等组织的抗氧化能力与氧化产物相关指标，包括：过氧化氢酶（Catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢（Hydrogen peroxide，H2O2）和 丙 二 醛（Malondialdehyde，MDA）。具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。利用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统观察肝细胞密度和规则程度等形态特征。

1.7 统计分析

试验结果以“平均值±标准误”（Mean±SEM）表示。试验各组间的差异采用统计软件SPSS 17.0 中的Duncan's 法进行多重比较。当P＜0.05 时认为各组间差异显著。

2 结果

2.1 Gln对灌服SPI仔猪肝脏组织形态结构的影响

图1 Gln对灌服SPI仔猪肝脏组织形态结构的影响

如图1 所示，对照组肝细胞形态结构正常，大小一致，肝细胞以中央静脉为轴心呈放射状排列呈索状，肝细胞界限清楚，核圆而大；而SPI 组肝细胞细胞形态失常，排列错乱，出现大面积的细胞空泡化，脂肪变性，部分细胞细胞核变形、溶解；与SPI组相比，SPI+Gln组肝细胞空泡化程度减轻，细胞大小一致，形态结构正常，界限清晰，肝细胞排列正常。

2.2 Gln对灌服SPI仔猪肝脏抗氧化能力的影响

表1 Gln对灌服SPI仔猪肝脏抗氧化能力的影响

表1可见，与对照组相比，SPI组显著降低了仔猪肝脏H2O2含量（P＜0.05），但显著升高了仔猪肝脏MDA的含量（P＜0.05）。与SPI组相比，SPI+Gln显著降低了仔猪肝脏MDA 含量（P＜0.05），并显著提高了GSH-Px的活性（P＜0.05）。

2.3 Gln对灌服SPI仔猪腓肠肌抗氧化能力的影响

表2 Gln对灌服SPI仔猪腓肠肌抗氧化能力的影响

表2可见，与对照组相比，灌服SPI显著升高了仔猪腓肠肌H2O2含量（P＜0.05），显著降低了腓肠肌CAT和GSH-Px 活性（P＜0.05）。SPI+Gln 可缓解SPI 仔猪腓肠肌H2O2含量的上升（P＜0.05）。

2.4 Gln对灌服SPI仔猪背最长肌抗氧化能力的影响

与对照组相比，灌服SPI 显著升高了仔猪背最长肌MDA含量（P＜0.05），显著降低了仔猪背最长肌CAT与GSH-Px 活性（P＜0.05）。与SPI 组相比，SPI+Gln 组显著升高了仔猪背最长肌MDA 含量，降低了仔猪背最长肌T-SOD活性（P＜0.05），结果如表3。

表3 Gln对灌服SPI仔猪背最长肌抗氧化能力的影响

3 讨论

3.1 Gln对灌服SPI仔猪肝脏组织形态结构和抗氧化功能的影响

大豆分离蛋白中含有的大豆抗原蛋白会导致新生仔猪发生一些不良的生理反应[6-9]。Gln在机体的许多组织中都能被合成，但在剧烈运动、创伤、感染等应激和高分解状态下，Gln 的代谢发生改变[15]，肝脏对Gln 的摄取显著增加，并由Gln 释放器官变成消耗器官，此时补充Gln 对机体具有重要的保护作用[16]。肝脏是脂肪代谢的重要器官，它对脂肪的摄取，氧化，脂肪酸的代谢，胆固醇的生成，磷脂和脂蛋白的合成及脂蛋白的分泌均起着中枢性作用[17]，在整个机体中起着至关重要的作用。Ascencio等[18]发现大豆蛋白可能通过改变血液胰岛素水平，进而降低了肝脏内转泌调控因子SREBP（sterol-regulatory element binding protein，固醇调节元件结合蛋白）的表达，从而导致肝脏内脂肪的合成降低。Takamatsu 等[19]应用基因芯片技术检测了摄食大豆蛋白日粮对大鼠肝脏基因表达谱的影响，发现与酪蛋白相比，大豆蛋白改变了约33%的定量基因的表达，其中与脂质代谢有关的基因集显著变化。于健春等[13]的研究表明，Gln 能够通过增加谷胱甘肽的生物合成及其在肝脏的贮存来保护肝脏功能。本试验仔猪肝脏病理切片显示，SPI 导致肝细胞出现严重的细胞空泡化，脂肪变性，且部分细胞细胞核变形、溶解，而Gln 的添加缓解了肝细胞空泡化程度，使细胞形态结构和肝细胞索排列趋于正常。表明大豆分离蛋白使仔猪肝脏受到损伤，可能与大豆分离蛋白组仔猪肝脏脂质代谢出现异常有关，而补充谷氨酰胺能够改善机体代谢异常的情况[16]，在一定程度上缓解仔猪因大豆分离蛋白处理而导致的肝脏损伤。

肝脏是氧化应激的易发器官，张相伦[20]的研究表明氧化大豆抑制肉鸡肝脏和肠道抗氧化酶系统的发育，吴秋萍等[21]研究发现大豆蛋白小鼠肝脏自由基水平升高，组织抗氧化酶活力显著下降，MDA大量积累，使小鼠进入氧化应激状态。Gonzales等[22]的研究表明Gln可能通过清除体内的氧自由基，减轻肝脏解毒负担，从而保护肝细胞并提高机体抗氧化能力。王伟强[23]的研究表明，在CCl4诱导大鼠急性肝损伤的模型中，补充Gln可以增加肝细胞线粒体中GSH的合成，维持肝组织及血浆中GSH的浓度，从而保护肝脏并提高机体抗氧化的能力。MDA是重要的脂质过氧化产物之一，测定MDA的含量常能反映机体的脂质过氧化水平，间接反映细胞受损伤的程度[24]。本试验条件下，大豆分离蛋白使仔猪肝脏MDA活性显著上升，破坏了氧化还原状态的平衡。谷氨酰胺的添加使仔猪肝脏MDA含量下降与GSH-Px活性增强，谷氨酰胺可能通过提高抗氧化相关酶活性和降低氧化产物的含量来增强仔猪的抗氧化能力，进而缓解SPI仔猪肝脏抗氧化功能的降低。这也可能是Gln改善SPI仔猪肝脏细胞形态的一种作用机制。

3.2 Gln 对灌服SPI 仔猪腓肠肌、背最长肌抗氧化功能的影响

大豆作为主要植物蛋白质饲料，其所含的大豆蛋白易引发仔猪腹泻、生长受阻等负面影响[6-9]。另外有研究表明，大豆蛋白会导致小鼠血液及消化器官自由基显著增加、组织抗氧化能力降低[21]。氧化还原反应是机体最重要的生理活动之一，氧化与抗氧化系统的失衡会导致机体各方面的功能出现异常。正常情况下，机体的氧化和抗氧化系统存在动态平衡，SOD、GSH-Px和CAT能通过清除超氧阴离子，维持机体氧化和抗氧化系统平衡，从而保护组织细胞免受损伤[25-26]。而早期断奶仔猪由于营养、环境、心理等的不适应，容易发生应激进而产生大量的自由基，而过量自由基生成MDA 等脂质过氧化产物及新的自由基，并可进一步通过链式反应放大损害作用，引起细胞代谢功能障碍和死亡[27]。本试验条件下，大豆分离蛋白使仔猪腓肠肌H2O2含量、背最长肌MDA含量显著升高，且使仔猪腓肠肌和背最长肌CAT 与GSH-Px 酶活性显著降低。说明大豆分离蛋白破坏力机体氧化与抗氧化系统的平衡，使得仔猪腓肠肌、背最长肌抗氧化能力降低。添加谷氨酰胺使仔猪腓肠肌H2O2含量下降，在一定程度上缓解了大豆分离蛋白对腓肠肌造成的氧化损伤。

4 结论

大豆分离蛋白诱导仔猪肝脏组织形态异常并降低肝脏和肌肉的抗氧化能力。而谷氨酰胺可有效缓解大豆分离蛋白仔猪肝细胞损伤，并提高仔猪肝脏与腓肠肌的抗氧化能力。