吡虫啉对伯克霍尔德氏菌生长和溶磷作用的影响*

郑丽霞，王玉书，刘 海，黄建国†

吡虫啉对伯克霍尔德氏菌生长和溶磷作用的影响*

郑丽霞1，王玉书1，刘 海1，2，黄建国1†

（1. 西南大学资源环境学院，重庆 400716；2. 贵州省农业科学院农业科技信息研究所，贵阳 550006）

吡虫啉；无机磷细菌；溶磷

吡虫啉（Imidacloprid）又名氯化烟碱，是目前国内外施用最广、用量最大的新型烟碱类高效杀虫剂，广泛用于植物生产、宠物和野生动物等的寄生虫防治。杀虫谱广、效果好、毒性低、不易产生抗性，对非靶标生物—人、家畜、鱼类和天敌昆虫比较安全。但是，该杀虫剂的残留期较长，约25 d[1]。在作物虫害防治过程中，吡虫啉主要施于土壤和叶面或用于浸种，防治粮食作物、经济作物和蔬果虫害，如飞虱、叶蝉和蚜虫等多种刺吸式口器和咀嚼式口器害虫[2-3]。吡虫啉施用之后，经直接或间接途径进入土壤[4]，可能影响微生物生命活动、种群结构和生态功能等，进而影响土壤有机质矿化、毒物降解、养分活化，氮素循化等生物化学过程[5-6]。用吡虫啉防止豆科植物虫害，根瘤数减少，瘤体减小，瘤重减轻，生物固氮受到抑制[7]。

在农业生产中，磷是作物需要的“三要素”之一。可溶性磷肥施入土壤之后，由于强烈的固定作用，其利用率一般不超过25%[8-9]。为了满足日益增长粮食需要，只得大量施用磷肥以维持作物产量。但大量施肥造成一系列生产、土壤和环境问题，如肥效降低、土壤磷积累、水体富营养化等。从全球土壤平均含磷量看，目前积累在土壤中的磷高达1 584 kg·hm–2，若能有效利用则可持续满足约350年的作物生产需要[10]。因此，活化利用土壤中积累的磷有益于减施磷肥，保持农业生产的可持续发展。在土壤中，无机磷细菌（Inorganic phosphate- solubilizing bacteria，IPSB）是重要的有益微生物，它们能分泌氢离子（H+）和低分子有机酸，包括草酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸等，溶解或络合沉淀土壤难溶性无机磷酸盐中的钙、镁、铁、铝等，释放可溶性磷，提高有效含量[11]。因此，利用IPSB挖掘利用土壤难溶性是供给作物磷素营养，提高磷肥利用率重要策略之一[12-13]。

伯克霍尔德氏菌（）分布广泛，具有多种多样的生理生态功能，它们不仅能溶解土壤难溶性无机磷酸盐，增加有效磷含量，而且还能增强作物抗病能力，提高产量品质[14-15]。在葡萄糖、草酸铵和氯化钠组成的液体培养基中，P0417的溶磷能力与培养液pH密切相关，H+分泌量越高，对Ca3（PO4）2溶解作用愈强，溶磷量高达791.84 μg· mL–1[14]。在农业生产中，使用化学农药防治病虫害的现象十分普遍，其机理也有深入研究，但对土壤IPSB种群结构和生理功能的影响研究甚少。为此，本研究以的3株IPSB为供试菌株，利用固体和液体培养技术，设置不同浓度吡虫啉处理，研究其生长繁殖、对Ca3（PO4）2溶解影响及其有关机理，目的是了解该农药对土壤IPSB种群结构和溶磷作用的影响，为合理使用吡虫啉提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

IPSB菌株：3株伯克霍尔德氏菌（B05、B07和B09），分离自重庆市缙云山国家森林公园的砂岩黄壤（106º20′ E，29º49′ N，pH 4.34），保存于西南大学资源环境学院微生物—植物营养实验室。

固体培养基（g·L–1）：10葡萄糖、2.5 Ca3（PO4）2、0.5 （NH4）2SO4、0.2 NaCl、0.1 MgSO4.7H2O、0.2 KCl、0.5酵母膏、0.002 MnSO4.4H2O、0.002 FeSO4.7H2O、20琼脂、1 L蒸馏水，pH 7.0～7.5。液体培养基则含琼脂。

吡虫啉：吡虫啉粉剂（含吡虫啉10%），上海悦联化工有限公司生产。

1.2 研究方法

蒸汽灭菌（121℃，1.5 kPa，30 min，下同）固体培养基。取保藏菌株，划线接种，25±1 ℃恒温暗培养72 h，无菌生理盐水洗涤，配成1´103cell·mL–1的菌悬液备用。在通常情况下，吡虫啉在土壤中的残留量≤10 mg·L–1，故当培养基冷却至50 ℃左右，加入吡虫啉，形成0、5、10和20 mg·L–1等不同浓度的处理，依次简称为对照、低、中、高浓度（下同）。取10 mL尚未固化的培养基，转移到直径为6.0 cm的培养皿中，冷却至常温（25～30 ℃）后，分别在培养基中央接种0.1 mL 菌悬液，25±1 ℃暗培养7 d，重复5次，用菌落测定仪测量菌落和透明圈直径，计算Ca3（PO4）2的溶解指数（溶磷指数）[16]：

溶磷指数 = （菌落直径+透明圈直径）/菌落直径

取100 mL液体培养基，置于250 mL 三角瓶中，蒸汽灭菌，待冷却至常温（25～30 ℃）后分别加入吡虫啉，形成0、5、10和20 mg·L–1等不同浓度的处理。然后，各接种1.0 mL菌悬液，摇床暗培养120 h（25±1 ℃、75 r·min–1），重复5次。

在培养至6、12、18、36、72、120 h时，各吸取5.0 mL菌悬液，用XSP-6C显微镜（上海迪诺力泰公司生产）观测计数IPSB。然后，10 000 r·min–1离心10 min。取上清液，先用pH电极测定pH，再用钼蓝比色法测定无机磷含量[17]，计算氢离子浓度（pH = –lg [H+]）和溶磷量（培养液无机磷浓度-对照培养液无机磷浓度）×培养液体积）[18]。培养结束后，用0.1 mol·L–1HCl酸化培养液，离心去除固体物质，用D-7000高效液相色谱仪（Hitachi Ltd.，Tokyo，Japan）测定有机酸浓度。色谱条件为：L-7455二级管阵列检测器，RezexRoa-Organic Acid 300离子交换柱（Phenomenex Ltd.，Los Angeles，USA），进样量20 μL，流动相2.5 mmol·L–1H2SO4，柱温35℃，压力3.1 MPa，流速0.5 mL·min–1，Diode Array L-7455紫外检测器，检测波长210 nm。检测的有机酸为乙酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸和草酸等，出峰时间依次为23.92、19.47、16.05、13.73和11.60 min。

1.3 数据处理

分别用 Excel 2010和SPSS 17.0进行基本计算、方差分析和LSD多重比较，显著水平为< 0.05；作图软件为SigmaPlot 12.5。

2 结 果

2.1 吡虫啉对IPSB生长和溶磷作用的影响

将供试菌株接种于固体培养基，随培养基中吡虫啉浓度提高，对IPSB的抑制作用显著增强，菌落直径的降幅高达39.81%～55.45%（图1，表1）。与之类似，B09的溶磷透明圈和溶磷指数显著减小；但B05和B07则相反，透明圈直径和溶磷指数增加，最大增幅分别为9.72%～19.44%和40.69%～106.94%。

在液体培养时，由于菌株不同，IPSB的生长速率也不一样（图2）。培养120 h后，IPSB在培养液中的平均密度变化于9.07×108～26.56× 108cell·mL–1，B07和B9的密度无显著差异，但显著高于B05。随吡虫啉浓度提高，IPSB在培养液中的密度呈逐渐降低的趋势，降幅高达49.87%～65.28%。

图1 在含吡虫啉的固体培养基上，3株IPSB的生长状况和溶磷圈

表1 固体培养时吡虫啉对IPSB生长和溶磷的影响

注：在同列中，有不同小写字母者表示差异显著（< 0.05），下同。Note：Means±standard deviations followed by different lowercase letters in each column are significantly different at< 0.05 level. The same below.

注：不同大写表示菌株间差异显著；不同小写字母表示吡虫啉浓度间差异显著（P < 0.05）。Note：Different capital and lowercase letters above the bars indicate significant difference among fungal strains and among imidacloprid concentrations at 0.05 level，respectively.

2.2 吡虫啉对IPSB分泌有机酸和H+的影响

由表2可知，供试验菌株均可分泌较多草酸和柠檬酸，二者合计超过有机酸分泌总量的67.65%，最高达83.28%。值得注意的是，IPSB分泌有机酸和H+的数量因菌株和吡虫啉浓度不同而有所差异。

就分泌草酸而言，B05、B07和B09的平均分泌量分别为1.01、1.29和1.45 mmol·L–1。在培养液中加入吡虫啉，随浓度提高，对B07和B09分泌草酸的抑制作用增强；但对B05的作用则相反，即吡虫啉浓度越高，分泌草酸的速率反而增加，最大增幅达到35.63%。供试株菌株的柠檬酸分泌量B09 < B05 < B07，平均分泌速率变化于0.15～0.73 mmol·L–1之间。在含吡虫啉的液体培养基中，B05分泌柠檬酸无显著变化，B07的分泌速率增加，B09显著降低；B09的乙酸分泌量低于检测限，B05的乙酸分泌量显著高于B07，分别为1.15～1.22 mmol·L–1和0.74～0.82 mmol·L–1。此外，在B05和B07的培养液中，未检测到分泌苹果酸；B09分泌苹果酸的速率随吡虫啉浓度增加而降低，最大降低幅度超过67.95%；B05和B09不分泌琥珀酸，吡虫啉对B07分泌琥珀酸无显著影响，变化于0.64～0.65 mmol·L–1。

表2 IPSB培养液中的有机酸和H+浓度

注：ND表示未检出 Note：ND，not detected

供试菌株H+平均分泌量依次为：B07（389.5mmol·L–1）、B09（172.2mmol·L–1）、B05（20.14mmol·L–1）。在培养液中加入不同浓度的吡虫啉，促进B05分泌H+；低浓度吡虫啉对B07分泌H+有促进作用；尽管低浓度吡虫啉对B09分泌H+无显著影响，但中、高浓度的吡虫啉仍表现出显著的抑制作用。

2.3 吡虫啉对IPSB溶磷量的影响

在培养液中，吡虫啉对IPSB溶解Ca3（PO4）2的影响因菌株和浓度而异（图3）。溶磷量B05最低、B09 次之、B07 最高。其中，B05和B09对Ca3（PO4）2的溶解量为=/（a+b），B07的溶磷量为=0+ a（1–e–bx）c（为培养时间）。此外，培养液中的吡虫啉浓度越高，B05对Ca3（PO4）2的溶解量愈大；在高浓度的吡虫啉培养液中，促进B07但抑制B09溶解Ca3（PO4）2；在低浓度的吡虫啉培养液中，B07和B09对Ca3（PO4）2的溶解量与对照无显著差异。

图3 在培养液中，吡虫啉对IPSB溶磷量的影响

2.4 有机酸和H+分泌与Ca3（PO4）2溶解的关系

相关性分析表明，在B07和B09培养液中，Ca3（PO4）2的溶解量分别与有机酸和H+分泌总量呈极显著线性正相关；但是，B05对Ca3（PO4）2的溶解量与有机酸和H+分泌总量相关不显著。将供试菌株作为整体进行统计时发现，Ca3（PO4）2的溶解量均与有机酸和H+分泌总量呈显著线性正相关（有机酸= 0.876**，氢离子= 0.823*，= 12，**< 0.01，*< 0.05）。此外，IPSB的H+和有机酸分泌总量也呈显著线性正相关（= 0.852*，= 12）。

3 讨 论

化学农药对土壤微生物数量、活性、种群结构及功能有重要影响[19]。当浓度大于10 mg·L–1时，吡虫啉对供试IPSB的生长繁殖均有不同程度的抑制作用，在固体培养时菌落减小，液体培养时密度降低。据报道，吡虫啉显著抑制青海弧菌（Q67）、费氏弧菌（）和发光杆菌（T3）的生长繁殖，表现出较强生物毒性[20-21]。吡虫啉抑制土壤硫酸盐还原菌（Q235）产酸，可能减轻土壤酸化，但增强对金属材料的腐蚀作用[22]。培养试验表明，吡虫啉抑制水稻条纹病毒（Rice stripe virus）的NSvc4、CP、NS3和SP等多个基因的表达，降低CP和SP基因所控制的蛋白质合成[23]；利用电子显微镜观察还发现，吡虫啉可破坏某些微生物细胞内的线粒体、细胞膜、高尔基体的结构，并使DNA发生断裂、扭曲和形状改变[23]。此外，在酶促作用下，吡虫啉在昆虫和微生物体内发生去饱和、脱烷基、甲基化、羟基化、酯化和硝基化等一系列生物化学反应，产物包括胍、脲、5-羟基吡虫啉和亚硝基胍等[25]。其中亚硝基胍为烷基化剂，可作用于DNA双螺旋结构中的多个靶点，造成基因突变，使昆虫和微生物代谢改变，生长繁殖异常，或使细胞形态发生畸变、解体、死亡[26]。

多数IPSB属于根际微生物，除活化土壤难溶性无机磷酸盐和改善植物磷素营养之外，还能合成植物激素和生长活性物质，如生长素、水杨酸、嘌呤类、细胞分裂素等，调节植物生长发育[27]。在加入吡虫啉的固体和液体培养基中，不同程度地降低了供试IPSB的菌落直径和在培养液中的密度，说明吡虫啉抑制了它们的生长繁殖。与此同时，B09溶解Ca3（PO4）2的能力降低，但随吡虫啉浓度提高，B05和B07对Ca3（PO4）2的溶解量增加，说明即使供试IPSB属于同一个种，吡虫啉对它们生长繁殖和溶解Ca3（PO4）2的影响也不完全相同。这意味着在农业生产中，大量使用吡虫啉可能改变土壤IPSB的群落结构，影响供试菌株对土壤难溶性无机磷酸盐的溶解。

值得注意的是，类似于其他IPSB种群，供试3株伯克霍尔德氏菌均能分泌H+、草酸和柠檬酸，B07还能分泌琥珀酸和乙酸，B09分泌苹果酸，B05分泌乙酸。菌株之间H+和各种有机酸的分泌量也有所不同，这意味着在不同供试菌株之间，H+和有机酸代谢（或分泌）各异。不同代谢（或分泌）途径对吡虫啉敏感性可能有所差异，这可能也是吡虫啉对IPSB溶解Ca3（PO4）2产生不同影响的重要原因之一。在土壤中，IPSB分泌的H+和有机酸不仅能活化难溶性磷酸盐，溶解钙镁，提高磷、钙、镁的生物有效性，而且还可溶解含钾矿物，既能释放钾离子，又可减少钾离子固定，提高钾肥利用率[30]。此外，由于草酸、柠檬酸和苹果酸等低分子有机酸络合（沉淀）重金属的能力较强，故存在于根系周围的有机酸可减少植物吸收重金属，减轻危害[34]。在农业生产中，防治虫害施用的吡虫啉进入土壤之后，不同程度地抑制IPSB的生长繁殖，可能影响其种群结构和溶磷功能。由于人工纯培养试验与田间自然情况的差异较大，很有必要进一步开展田间研究。

4 结 论

吡虫啉不同程度地抑制IPSB繁殖生长，促进B05和B07但降低B09的溶磷能力；供试菌株均能分泌H+和不同种类的有机酸，参与Ca3（PO4）2溶解；在不同菌株之间，有机酸代谢、H+分泌和溶解Ca3（PO4）2的机制有所不同，这可能是供试IPSB的溶磷作用对吡虫啉产生不同响应的主要原因之一。因此，在农业生产中，施用吡虫啉防治作物虫害对土壤IPSB种群结构和溶磷功能等的影响可能因IPSB株系不同而异。

［1］ Cai D S，Huang X P，Jiang D J，et al. Study on the formulation of 70% imidacloprid WG. Guangdong Chemical Industry，2013，40（24）：49—50. [蔡德胜，黄雪萍，蒋殿君，等. 70% 吡虫啉水分散粒剂的研制. 广东化工，2013，40（24）：49—50.]

［2］ Cang T，Wang Y H，Wu C X，et al. Acute toxicity risk assessment of neonicotinoid insecticides to Hon-eybees （L.）. Asian Journal of Ecotoxicology，2017，12（4）：285—292. [苍涛，王彦华，吴长兴，等. 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的急性毒性及风险评价. 生态毒理学报，2017，12（4）：285—292.]

［3］ Wang J J，Han Z J，Wang Y C. A review on the toxicology of new nicotinyl insecticides. Acta Phytophylacica Sinica，2001，28（2）：178—182. [王建军，韩召军，王荫长. 新烟碱类杀虫剂毒理学研究进展. 植物保护学报，2001，28（2）：178—182.]

［4］ Yu S Q. Study on residue of pesticide imidacloprid in water and soil. Chengdu：Southwest Jiaotong University，2016. [俞思绮. 农药吡虫啉在水体和土壤中的残留研究. 成都：西南交通大学，2016.]

［5］ Yang Q. Study on effects of planting years and pesticides on microbial number and enzyme activities in vegetables solar greenhouse soil. Lanzhou：Gansu Agricultural University，2013. [杨琴. 种植年限和农药对蔬菜日光温室土壤微生物数量及酶活性影响的研究. 兰州：甘肃农业大学，2013.]

［6］ Zheng X Z，Ding H，Lei J J，et al. Effect of imidacloprid and chlorpyrifos on the transformation of urea nitrogen in soil. Chinese Journal of Pesticide Science，2013，15（6）：648—654. [郑祥洲，丁洪，雷俊杰，等. 吡虫啉和毒死蜱对尿素氮在土壤中转化的影响. 农药学学报，2013，15（6）：648—654.]

［7］ Gong P，Sun T H，Li P J. Ecological effects of pesticides on soil microorganisms. Chinese Journal of Applied Ecology，1996，7（Sup）：127—132. [龚平，孙铁珩，李培军. 农药对土壤微生物的生态效应. 应用生态学报，1996，7（增）：127—132.]

［8］ Yang M Y，Wang C H，Wu Z H，et al. Phosphorus dissolving capability，glucose dehydrogenase gene expression and activity of two phosphate solubilizing bacteria. Acta Microbiologica Sinica，2016，56（4）：651—663. [杨美英，王春红，武志海，等. 不同条件下两株溶磷菌溶磷量及葡萄糖脱氢酶基因表达与酶活分析. 微生物学报，2016，56（4）：651—663.]

［9］ Han X F，Xie D T，Gao M，et al. Effect of reduced phosphorus fertilizer combining organic fertilizers and phosphorus dynamics changes in purple soil. Journal of Soil and Water Conservation，2016，30（6）：207—213. [韩晓飞，谢德体，高明，等. 紫色土减磷配施有机肥的磷肥效应与磷素动态变化. 水土保持学报，2016，30（6）：207—213.]

［10］ Pingale S S，Virkar P S. Study of influence of phosphate dissolving micro-organisms on yield and phosphate uptake by crops. Ciência & Saúde Coletiva，2017，19（9）：3809—3818.

［11］ Menezes-Blackburn D，Jorquera M A，Greiner R，et al. Phytases and phytase-labile organic phosphorus in manures and soils. Critical Reviews in Environmental Science and Technology，2013，43（9）：916—954.

［12］ Sreedevi S. Effect of hosphate solubilising bacteria bacillus IPSB24 on growth of tomato plants.  International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences，2016，5（7）：311—320.

［13］ Delfim J，Schoebitz M，Paulino L，et al. Phosphorus availability in wheat，in volcanic soils inoculated with phosphate-solubilizing bacillus thuringiensis. Sustainability，2018，DOI：10.3390/su10010144.

［14］ Huang D M，Li Q，Guan G Q，et al. Selection，identification and medium optimization of a phosphate-solubilizing bacterium. Biotechnology Bulletin，2015，31（2）：173—178. [黄达明，李倩，管国强，等. 一株解磷细菌的筛选、鉴定及其溶磷培养条件的优化. 生物技术通报，2015，31（2）：173—178.]

［15］ Yang J，Jiang Y，Wang X T，et al. Screening and identification of several endophytic diazotrophs with high capability of phosphate solubilizing and potassium decomposing from. Journal of Agricultural Biotechnology，2016，24（2）：186—195. [阳洁，江院，王晓甜，等. 几株高效溶磷解钾药用稻内生固氮菌的筛选与鉴定. 农业生物技术学报，2016，24（2）：186—195.]

［16］ Wang Y S，Liu H，Yuan L. Negative allelopathic effects of root exudate ofon growth and phosphate dissolution of inorganic phosphorus bacteria. Acta Pedologica Sinica，2017，54（6）：1486—1496. [王玉书，刘海，袁玲. 空心莲子草根系分泌物对IPSB的负化感效应. 土壤学报，2017，54（6）：1486—1496.]

［17］ Lu R K. Analytical methods for soil and agro-chemistry. Beijing：China Agricultural Science and Technology Press，2000. [鲁如坤. 土壤农业化学分析方法. 北京：中国农业科学技术出版，2000.]

［18］ Li J，Wang W L，Lu B L，et al. Selection and measurement of phosphate-solubilizing micro-organisms and their phosphate-dissolving ability in high calcium soil of Hexi corridor in Gansu Province（In Chinese）. Agricultural Research in the Arid Areas，2008，26（2）：7—10. [李娟，王文丽，卢秉林，等. 甘肃省河西高钙土溶磷菌筛选及其溶磷能力初步研究. 干旱地区农业研究，2008，26（2）：7—10.]

［19］ Karpouzas D G，Tsiamis G，Trevisan M，et al. “LOVE TO HATE” pesticides：Felicity or curse for the soil microbial community ? An FP7 IAPP Marie Curie project aiming to establish tools for the assessment of the mechanisms controlling the interactions of pesticides with soil microorganisms. Environmental Science & Pollution Research，2016，23（18）：1—5.

［20］ Zhu X W，Liu S S，Zhang Q，et al. Short-term and long-term toxicities of selected insecticides on phototobacteria.Research of Environmental Sciences，2009，22（5）：589—594. [朱祥伟，刘树深，张琼，等. 杀虫剂及抗生素对发光菌的短期毒性与长期毒性. 环境科学研究，2009，22（5）：589—594.]

［21］ Wu S H，Zhou D P，Xu Y T，et al. A cute toxicity of 18 kinds of pesticide to photobacteroa. Journal of Agro-Environment Science，2007，26（6）：2267—2270. [吴淑杭，周德平，徐亚同，等. 18种农药对发光细菌的急性毒性研究. 农业环境科学学报，2007，26（6）：2267—2270.]

［22］ Zhao L L，Zhao P，Sun C，et al. Reserch on the influence of pesticide to Q235 steel microbilogical corrosion. Journal of Shenyang Ligong University，2011，30（6）：22—24. [赵琳琳，赵平，孙成，等. 杀虫剂对Q235钢微生物腐蚀影响的研究. 沈阳理工大学学报，2011，30（6）：22—24.]

［23］Wang S，Fu H W，Yang Y Z. Stress effect of imidacloprid on RSV in rice plants. Chinese Journal of Applied Ecology，2014，25（12）：3593—3599. [王爽，伏红伟，杨益众. 吡虫啉对水稻体内条纹病毒的胁迫效应. 应用生态学报，2014，25（12）：3593—3599.]

［24］ Karabay N U，Oguz M G. Cytogenetic and genotoxic effects of the insecticides，imidacloprid and methamidophos. Genetics and Molecular Research，2005，4（4）：653—662.

［25］ Fan Y J，Shi X Y，Gao X W. Research progresses on the metabolism of neonicotinoids imidacloprid and thiamethoxam. Chinese Journal of Pesticide Science，2012，14（6）：587—596. [范银君，史雪岩，高希武. 新烟碱类杀虫剂吡虫啉和噻虫嗪的代谢研究进展. 农药学学报，2012，14（6）：587—596.]

［26］ Wang Q，Jin X H，Niu B L，et al. Mutagenesis breeding of nitrosoguanidine and optimization of fermentation conditions in high yield strain of Curdlan. Journal of Anhui Agricultural Sciences，2017，45（33）：83—86，105. [王钦，靳晓菡，牛宝琳，等. 可得然胶高产菌株的亚硝基胍诱变育种及其发酵条件的优化. 安徽农业科学，2017，45（33）：83—86，105.]

［27］ Zhao C X，Liu Q G，Zhang Z Y. Study on the ability of phosphoric bacteria and potassic bacteria in decomposing of phosphate and silicate. Journal of Hunan Agricultural University （Natural Sciences），2004，30（6）：519—521. [赵晨曦，刘前刚，张志元. 磷钾细菌解磷解钾能力的研究. 湖南农业大学学报（自然科学版），2004，30（6）：519—521.]

［28］ Zhang H X，Zhang Q L，Wang Z S，et al. Pesticide degrading mechanism in soil. World Sci-tech R&D，2009，31（1）：112—115. [张洪霞，张祺玲，王兆守，等. 土壤农药降解微生物及其作用机理. 世界科技研究与发展，2009，31（1）：112—115.]

［29］ Niu X G，Hua X Y，He S C. Studies on the potassium-disssolving ability of silicate bacteria. Chinese Journal of Soil Science，2005，36（6）：950—953. [钮旭光，华秀英，何随成.硅酸盐细菌解钾活性的研究. 土壤通报，2005，36（6）：950—953.]

［30］ Najafi S，Jalali M. Effect of heavy metals on pH buffering capacity and solubility of Ca，Mg，K，and P in non-spiked and heavy metal-spiked soils. Environmental Monitoring and Assessment，2016，https：//doi.org/10. 1007/s10661-016-5329-9 .

［31］ Fox T R，Comerford N B，Mcfee W W. Phosphorus and aluminium release from a spodic horizon mediated by organic acids. Soil Science Society of America Journal，1990，54（6）：1763—1767.

［32］ Gadd G M. Fungal production of citric and oxalic acid：Importance in metal speciation，physiology and biogeochemical processes. Advances in Microbial Physiology，1999，41：47—92.

［33］ Chen S H. Analytical chemistry. Beijing：China Agriculture Press，2013. [陈时洪. 分析化学. 北京：中国农业出版社，2013.]

［34］ Ding L，Shen S G，Liang S X，et al. Effect of different organic acids for heavy metal extraction from Pb，Zn and Cd contaminated soil. DEStech Transactions on Environment，Energy and Earth Science，2016，DOI：10.12783/dteees/edep2016/5898.

Effects of Imidacloprid on the Growth and P-Solubilization of

ZHENG Lixia1, WANG Yushu1, LIU Hai1, 2, HUANG Jianguo1†

(1. College of Resources and Environment, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2. Institute of Agricultural Science and Technology Information, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550006, China)

Imidacloprid, a new type of neonicotinoid insecticide with high pest control efficiency, is widely used in recent years. As this chemical insecticide has a long residual period (about 25 days), it is necessary to evaluate risks it might pose to beneficial microbes in the soils.Solid and liquid incubations were carried out simultaneously to investigate effects of the insecticide on growth, reproduction, and phosphorus (P)dissolving capacity of inorganic phosphate-solubilizing bacteria (IPSB), such asB05, B07 and B09, relative to concentrations of imidacloprid (0, 5, 10, and 20 mg·L–1).Imidacloprid inhibited to a varying extent the growth and reproduction of all the three strains of IPSB, with the diameter of bacterial colonies decreased by 39.81%～55.45% in solid incubation. The tested bacteria varied in solubilization of tricalcium phosphate in response to imidacloprid. B09 was lowered in diameter of P-dissolving halos and index in the presence of imidacloprid, but B05 and B07 behaved otherwise, with the diameter of P-dissolving halos and index reaching as high as 9.72%～19.44% and 40.69%～106.94%, respectively. In liquid incubations, imidacloprid also inhibited growth and reproduction of the three strains of IPSB, with the bacterial density decreased by 49.87%～65.28% in culture solutions. P solubilization capacibility of the bacterial strains varied with imidacloprid concentrations. Imidacloprid, regardless of concentration, stimulated P solubilization of B05. P solubilization of B07 varied in solutions low or mediumin concentration of imidacloprid, but increased in those high in imidacloprid concentrations compared with CK (without imidacloprid). B09 showed a similar tread to B07 in variation of P dissolving capacity in solutions low in imidacloprid concentrations, while it decreased greatly in solution medium or high in imidacloprid concentrations. All the three strains of bacteria were able to excrete protons, oxalate, and citrate. Oxalate and citrate accounted for 67.65%～83.28% of the total organic acids excreted. In addition, acetate was detected in culture solution with B05 and B07, malate with B09, and succinate with B07. Excretion of the organic acids was affected by not only imidacloprid concentration, but also strain of bacteria and type of organic acid. Furthermore, imidacloprid inhibited bacterial proton secretion by a varying degrees. The amount of P dissolved from tricalcium phosphate was positively related to the excretion of total organic acids (= 0.876,< 0.05,= 12) and to that of protons (= 0.823,< 0.05,= 12) as well.It could be concluded that imidacloprid inhibites growth and reproduction of the IPSB by a varying degree in the soil, thus affecting the effects of the bacterial excreting organic acids and protons, and hence the effect of promoting or inhibiting and P solubilization. So in pest controlling application of a large amount of imidacloprid could influence the activities, numbers, and functions of IPSB to a various extent, depending on type of the soil and group of IPSB.

Imidacloprid; Inorganic phosphate-solubilizing bacteria; Phosphorus solubilization

S144

A

10.11766/trxb201804100189

郑丽霞，王玉书，刘海，黄建国. 吡虫啉对伯克霍尔德氏菌生长和溶磷作用的影响[J].土壤学报，2020，57（1）：174–182.

ZHENG Lixia，WANG Yushu，LIU Hai，HUANG Jianguo. Effects of Imidacloprid on the Growth and P-Solubilization of[J]. Acta Pedologica Sinica，2020，57（1）：174–182.

* 重庆市科委重点项目（CSTC2018jscx-mszd0133）和贵州省烟草公司遵义市公司科研项目（201503）资助 Supported by the Major Project of Chonqing Science and Technology Bureau（No. CSTC2018jscx-mszd0133）and the Research Project of Zunyi Tobacco Company，Guizhou Province（No. 201503）

，E-mail：huang99@swu.edu.cn

郑丽霞（1993—），女，甘肃人，硕士研究生，主要从事土壤微生物研究。E-mail：1871809558 @qq.com

2018–04–10；

2018–07–21；

2018–11–02

（责任编辑：卢 萍）