茶氨酸联合γ-氨基丁酸改善CUMS大鼠抑郁症状的研究

周 月,付 敏,刘 欢

(天津医科大学公共卫生学院,天津 300070)

抑郁症是一种广泛存在的慢性疾病,可影响思想、情绪和身体健康。它的特点是情绪低落、缺乏活力、悲伤、失眠、无法享受生活[1]。据估计,在全球范围内,有将近3.5亿人患有抑郁症[2],其中许多人在接受了推荐的抗抑郁药物和心理治疗后仍未得到缓解[3]。如今,市场上的抗抑郁药存在着不良反应大、起效缓慢、疗效不尽人意等缺点[4]。所以除了传统抗抑郁药物的使用,从植物中寻找安全、高效的天然产物来改善和防治抑郁症已成为社会需求和研究热点。

近年来,天然产物在抗抑郁方面的应用研究成为热门课题,涉及的天然产物有大叶蒟、百合、花椒、酸枣仁和罗布麻等40多种,其有效成分主要为黄酮类、生物碱、多酚类化合物等。有研究发现柴胡中的主要成分柴胡皂苷可降低海马中JNK、Bad蛋白表达控制慢性不可预知温和刺激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)大鼠的抑郁症状[5]。酸枣仁中的有效成分酸枣仁总生物碱、酸枣仁皂苷以及酸枣仁总黄酮也有一定的抗抑郁作用,如酸枣仁总生物碱可缩短小鼠悬尾的不动时间[6]。罗布麻叶总黄酮提取物可提高CUMS大鼠旷场运动水平[7]。植物中的天然产物以其无毒安全、抗抑郁疗效显著等优势,也是筛选抗抑郁新药的重要资源。

我国茶叶资源丰富,茶叶中主要活性成分如茶多酚、茶色素、茶多糖等,已被证实具有抗肿瘤、抗氧化、改善心血管疾病等一系列特殊保健功能[8],动物实验发现普洱茶茶色素的主要成分——茶褐素能够抑制高糖饮食大鼠血糖升高及体重增加[9]。茶叶中含有的L-茶氨酸(L-Theanine)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)也有很好的医用保健价值。L-茶氨酸是茶叶中含有的一种特殊的非蛋白质氨基酸[10],对大鼠具有显著的抗焦虑作用[11],可显著降低小鼠强迫游泳试验和悬尾试验中的不动时间[12],提高CUMS大鼠脑组织中单胺类神经递质的浓度改善抑郁症状[13-14]。

GABA是一个四碳非蛋白质氨基酸,广泛存在于动物、植物和微生物中[15],是一种介导抗癫痫药物、抗焦虑药物、镇静药物、抗惊厥药物、肌肉迟缓药物的多功能药物作用的重要靶标[16]。近年来的研究发现GABA的组织浓度与老年认知有关[17],在组织中合成,摄取和释放受损与慢性应激引起的抑郁样行为有关[18],具有高水平GABA的新型茶可降低小鼠强迫游泳试验和悬尾试验中的不动时间[19-20]。

目前尚无关于L-茶氨酸和GABA两者联合干预防治抑郁症的研究,因此本研究建立CUMS抑郁大鼠模型进行联合干预,分析其行为学变化及血清和脑组织中单胺类神经递质等指标。评价L-茶氨酸和GABA的联合抗抑郁作用,为天然产物抗抑郁提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF级SD大鼠 50只,雄性,体重220～240 g,8周龄,由北京维通利华实验动物有限公司提供,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2016-0006号,实验动物饲养于中国医学科学院放射医学研究所动物实验中心,温度长期控制在20～25 ℃,相对湿度维持在55%～65%。所有实验大鼠在实验开始前于动物房中适应性喂养1周,不限制饲料和水的摄入;基础饲料(纯化饲料) 由南通特洛菲饲料科技有限公司提供;茶氨酸、GABA混合物 由汤臣倍健股份有限公司提供;混合物包括(实验方法分组剂量中标注的GABA和茶氨酸的剂量为有效成分的实际含量):GABA单品(纯度95%)、茶氨酸单品(纯度20%)、辅料(微晶纤维素、无水乳糖、交联羧甲基纤维素钠)作为无任何抗抑郁作用的填充剂、崩解剂、助流剂、西酞普兰 美国Sigma公司;BCA法蛋白质检测试剂盒 南京建成科技有限公司;BDNF Elisa试剂盒、IL-6 Elisa试剂盒、β-内啡肽Elisa试剂盒 武汉华美生物科技有限公司;多巴胺标准品、五羟色胺标准品、去甲肾上腺素标准品 上海源叶生物科技有限公司。

OFT-100大小鼠开场活动实验系统 成都泰盟软件有限公司;TM-Vision行为学实验系统 成都泰盟软件有限公司;Bio-Tek SynergyMx多功能酶标仪 美国Bio-Tek宝特;3-18 k离心机 美国Sigma公司;-80 ℃低温冰箱 海尔集团;UltiMate 3000高效液相色谱仪 美国Thermo Fisher公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及干预方法 大鼠适应性饲养结束后根据体重分层随机分为正常对照组(对照组)、CUMS模型组(模型组)、CUMS+低剂量组(低剂量组)、CUMS+高剂量组(高剂量组)和CUMS+西酞普兰组(西酞普兰组),每组10只。

对照组和模型组灌胃生理盐水;低剂量组灌胃剂量(茶氨酸15 mg/kg/d+GABA 20 mg/kg/d);高剂量组灌胃剂量(茶氨酸45 mg/kg/d+GABA 60 mg/kg/d);西酞普兰组灌胃剂量10 mg/kg/d。灌胃体积均为10 mL/kg/d。

1.2.2 模型建立 本实验以CUMS进行抑郁模型的建立,采用的刺激包括:禁食或禁水24 h/次,4 ℃冰水游泳5 min/次,垫料潮湿8 h/次,束缚笼束缚2 h/次,止血钳夹尾1 min/次,噪声刺激2 h/次,昼夜颠倒24 h/次。除对照组大鼠以外其余四组均每日随机给予2种刺激。

1.2.3 实验时间 大鼠给予CUMS刺激第1 d记为实验的第1 d,第1 d慢性刺激前大鼠内眦取血。模型建立第45 d取血并进行糖水偏好实验和旷场实验,记为实验第45 d。第46 d开始进行灌胃药物干预,45 d后进行糖水偏好实验和旷场实验,最后取血和脑组织,记为实验第90 d。

图1 实验方法及过程时间流程图Fig.1 Flow chart of experimental method and process time

1.2.4 体重记录 实验的第1、45、90 d,对所有组别大鼠禁食12 h,禁食完后称量体重并记录。最后分别计算出第1～45 d、45～90 d各组体重增量。

1.2.5 糖水偏好实验 每次糖水偏好实验需要4 d,首先将大鼠置于隔噪音、安静的房间内训练适应含糖饮水1 d,每笼每只大鼠同时放置两个装有2%蔗糖水的500 mL水瓶。第2 d给予每只大鼠500 mL/瓶的2%蔗糖水和500 mL/瓶的纯净水。后1 d禁食禁水。最后1 d,进行动物的糖水消耗实验,同时给予每只大鼠预先定量好的100 mL/瓶的2%蔗糖水和100 mL/瓶的纯净水,2 h后测量糖水消耗量及其纯净水消耗量,并计算动物的糖水偏好[糖水偏好率(%)=糖水消耗/总液体消耗]。

1.2.6 旷场实验 在实验的第45、90 d各进行一次旷场实验。每次实验前让大鼠在安静环境中适应2 h,实验装置为625 mm(L)×740 mm(W)×510 mm(H)四周底面全部涂黑的箱子,实验在安静环境下进行,将一只大鼠小心置于箱底中心,记录组别,用摄像系统观察并记录5 min内大鼠的活动情况。观察指标包括水平运动-运动距离;垂直运动-站立次数:前肢离开水平地面高度1 cm以上的次数。每次做完后用90%的乙醇溶液清理实验箱,清除上一只大鼠的气味,尿液及其粪便。

1.2.7 血清和脑组织中五羟色胺和多巴胺含量的检测 采用高效液相色谱-荧光法(HPLC-FD):将血液于室温条件下放置2 h,12000×g离心l0 min,取上清液进行100 μL加入等体积的5%(v/v)高氯酸溶液,4 ℃ 12000×g离心10 min,将上清液取出在相同条件下再离心10 min取上清液过0.22 μm滤膜上样分析。每mg脑组织加入20 μL的0.1 mol/L的HClO4,用细胞破碎仪混匀,4 ℃ 20000×g离心20 min,取500 μL上清液,加125 μL的0.5 mol/L的Na2CO3,4 ℃ 20000×g离心10 min,过0.22 μm滤膜上样分析。

色谱条件:色谱柱选用反相色谱YMC-pack-ODS-a(100 mm×4.0 mm,3 μm);流动相:0.l mol/L磷酸二氢钾/甲醇(85∶15,V/V)溶液;流速:0.75 mL/min;荧光检测激发波长和发射波长分别为278、338 nm;进样量:20 μL;室温下测定。

1.2.8 血清和脑组织中白介素-6、脑源性神经营养因子(BDNF)和β-内啡肽含量的检测 采用酶联免疫吸附法(Elisa):脑组织用PBS洗去血污剪成小块,每100 mg脑组织加入1 mL PBS制成匀浆,然后4 ℃ 5000×g离心10 min取上清进行测定。按照Elisa试剂盒说明书要求检测脑组织和血清中IL-6、BDNF、β-内啡肽的含量。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 体重变化

体重变化可以反映大鼠食欲情况,抑郁可引起大鼠厌食,进而导致体重下降。如表1所示,1～45 d CUMS刺激组大鼠体重增量显著低于对照组(P<0.05),说明大鼠进食减少,出现厌食、消瘦的抑郁症状，造模成功。45～90 d高、低剂量干预组和西酞普兰组大鼠体重增量显著高于模型组(P<0.05),高剂量组体重增量大于低剂量组(P<0.05),与西酞普兰组无明显差异(P>0.05)。说明L-茶氨酸和GABA联合干预可提高大鼠食欲,增加体重增长速度。

表1 各组大鼠体重增量比较(n=10)Table 1 Weight increment of rats in each group(n=10)

注:*:与对照组相比,P<0.05;#:与模型组相比,P<0.05;&:与低剂量组相比,P<0.05;Δ:与西酞普兰组相比,P<0.05；表2～表8同。

2.2 糖水偏好实验

糖水偏好实验模拟人类幸福感快感,是反映大鼠快感的有效指标,是检验大鼠抑郁模型是否造模成功的专业指标。由表2可知,第45 d时,与对照组相比,CUMS处理组大鼠糖水偏好程度显著降低(P<0.05),说明CUMS刺激显著降低大鼠糖水偏好程度,大鼠造模成功。第90 d高、低剂量组、西酞普兰组糖水偏好程度显著高于模型组(P<0.05),说明L-茶氨酸和GABA联合干预可提高大鼠的糖水偏好程度,改善抑郁症状;且高剂量组糖水偏好程度显著高于低剂量组(P<0.05),与西酞普兰组之间没有显著差异(P>0.05),说明L-茶氨酸和GABA高剂量抗抑郁作用更为显著,与抗抑郁药物西酞普兰疗效无差异。

表2 各组大鼠糖水偏好程度比较(n=10)Table 2 Comparison of sugar and water preference of rats(n=10)

2.3 旷场实验

旷场实验可以反映大鼠活动及对新鲜环境的好奇度,其中水平运动反映大鼠运动活动度水平,垂直运动反映其对外界新鲜环境的好奇探测程度和欲望程度。由表3可知CUMS刺激后第45 d,各组水平运动和垂直运动水平均低于对照组(P<0.05),说明慢性刺激后大鼠旷场试验的水平运动和垂直运动均明显降低。

表3 各组大鼠旷场实验运动距离和站立次数比较(n=10)Table 3 Comparison of the distance of exercise and the number of standing times in the open field test of rats(n=10)

表4 各组大鼠血清、脑组织5-HT含量比较(n=10)Table 4 Comparison of 5-HT contents in serum or brain tissue of rats(n=10)

第90 d,与模型组比较,高、低剂量组、西酞普兰组大鼠水平运动距离和垂直运动的站立次数均显著增长(P<0.05),且高剂量组站立次数高于低剂量组(P<0.05)，与西酞普兰组差异无统计学意义(P>0.05),说明L-茶氨酸和GABA联合干预可增加CUMS抑郁大鼠旷场实验的运动距离和站立次数,提升对外界环境的好奇程度,改善抑郁行为。

2.4 脑组织和血清中单胺类神经递质的含量

如表4、表5所示，第45 d,各组与对照组相比血清中5-HT、DA水平均明显降低(P<0.05)。说明抑郁模型建立后大鼠体内5-HT、DA水平降低。

表4中第90 d,与模型组相比,高、低剂量组和西酞普兰组血清5-HT水平显著升高(P<0.05),高剂量组与西酞普兰组血清5-HT水平相比无明显差异(P>0.05);高剂量组和西酞普兰组脑组织中的5-HT水平显著高于模型组(P<0.05),且高剂量组的5-HT水平显著高于低剂量组(P<0.05),高剂量组与西酞普兰组脑组织的5-HT水平相比也无明显差异(P>0.05)。

第90 d(表5),与模型组相比，高、低剂量组和西酞普兰组血清DA水平显著升高(P<0.05),脑组织中的DA水平有显著升高(P<0.05);高剂量组与西酞普兰组血清和脑组织中的5-HT、DA水平相比均无明显差异(P>0.05)。说明L-茶氨酸和GABA联合作用可升高抑郁大鼠体内5-HT、DA的水平。

表5 各组大鼠血清、脑组织DA含量比较(n=10)Table 5 Comparison of DA contents in serum or brain tissue of rats(n=10)

2.5 脑组织和血清中IL-6、BDNF、β-内啡肽的含量

第45 d,与对照组比较,接受CUMS刺激各组血清IL-6水平显著升高,BDNF和β-内啡肽水平明显降低,差别具有统计学意义(P<0.05),说明CUMS刺激造成的抑郁症状,可升高大鼠体内炎症因子水平,降低BDNF和β-内啡肽水平，见表6～表8。

第90 d,高、低剂量组和西酞普兰组血清中的IL-6含量低于模型组(P<0.05),BDNF和β-内啡肽含量高于模型组(P<0.05);且高剂量组血清中的IL-6含量低于低剂量组(P<0.05),BDNF和β-内啡肽含量高于低剂量组(P<0.05),而高剂量组与西酞普兰组的IL-6、BDNF、β-内啡肽含量相比差异无统计学意义(P>0.05)。脑组织中的结果与血清中的一致。说明L-茶氨酸和GABA联合作用可降低抑郁大鼠体内的IL-6水平,升高BDNF和β-内啡肽水平。

表6 各组大鼠血清、脑组织IL-6含量比较Table 6 Comparison of serum or brain tissue IL-6 contents of

表7 各组大鼠血清、脑组织BDNF含量比较Table 7 Comparison of serum or brain tissue BDNF contents of

表8 各组大鼠血清和脑组织β-EP含量比较Table 8 Comparison of serum or brain tissue β-EP contents in of

3 讨论与结论

本研究发现CUMS抑郁大鼠在L-茶氨酸和GABA联合干预后,高低剂量组大鼠的抑郁行为均有所改善,与模型组相比体重增长、糖水偏好程度升高、旷场实验的运动距离和站立次数均增加,表明大鼠食欲有所恢复、幸福感和快感回升、对新鲜环境的好奇程度提高,说明L-茶氨酸和GABA联合干预有改善抑郁的作用。

目前研究表明L-茶氨酸改善CUMS大鼠抑郁症状的最低灌胃剂量20 mg/kg/d[13-14]。有GABA对慢性应激大鼠认知功能的研究中使用的剂量为500 mg/kg/d,大鼠在电迷宫实验中表现为潜伏期时间明显低于模型组[21]。本研究中低剂量组为(L-茶氨酸15 mg/kg/d+GABA 20 mg/kg/d),其中L-茶氨酸低于其他文献中最低作用剂量20 mg/kg/d,但仍表现出了缓解抑郁的作用,说明GABA协同L-茶氨酸改善了CUMS大鼠的抑郁症状。高剂量组为(L-茶氨酸45 mg/kg/d+GABA 60 mg/kg/d),GABA的干预剂量远远低于其他研究中的500 mg/kg/d,同样说明L-茶氨酸和GABA对改善大鼠抑郁行为具有协同增效作用。西酞普兰是一种高选择性的5-羟色胺再摄取抑制剂,是临床治疗抑郁症的常规药物[22],常做为抗抑郁研究的阳性对照[23-25]。L-茶氨酸+GABA高剂量组与西酞普兰组大鼠的糖水偏好程度、体重增量、旷场实验的运动距离和站立次数均无明显差异,说明高剂量的L-茶氨酸联合GABA抗抑郁作用显著。

单胺类神经递质5-HT、DA在中枢神经系统中起着非常重要的作用,单胺假说的主要内容是脑内单胺类神经递质缺乏与抑郁症的发病密切相关[26]。本研究发现CUMS大鼠血清及脑组织5-HT、DA水平降低,L-茶氨酸和GABA联合干预后水平上升且高低剂量组差异显著,说明L-茶氨酸和GABA联合干预改善抑郁症状与提高体内单胺类神经递质水平有关。

神经递质水平的改变可能为L-茶氨酸和GABA直接或间接影响造成。有研究发现L-茶氨酸通过血脑屏障进入脑组织后,纹状体、下丘脑和海马中的5-HT和DA浓度显著增加[27],脑缺血再灌注损伤模型大鼠在茶氨酸干预后,皮质GABA含量显著升高[28],L-茶氨酸预防喹啉酸诱导的运动功能障碍和纹状体神经毒性的实验中L-茶氨酸干预大鼠纹状体5-HT、DA和GABA浓度均显著升高[29],而GABA与5-HT、DA之间均具有相互正向调节作用[30]。

白介素-6(interleukin-6,IL-6)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)和β-内啡肽(β-endorphin,β-EP)也是评价抑郁症的重要指标。抑郁症患者IL-6浓度显著高于正常健康人[31]。药物治疗使脾脏IL-6生成减少[32]。BDNF是保护性免疫因子,重度抑郁症患者血清BDNF水平较低[33],而通过抗抑郁药治疗,可提高BDNF水平[34]。β-EP作为主要的内阿片样物质,参与欣快、报酬行为等情绪调节活动。电针抗抑郁研究中,CUMS大鼠血清β-EP水平降低,电针治疗后含量升高,抑郁行为改善[35]。IL-6、BDNF、β-EP之间存在一定调节关系。有研究证明了BDNF对IL-6的负向调节作用[36],β-EP可介导对免疫功能的负向调节,下调分泌增多的促炎性细胞因子及免疫介质[37]。IL-6、BDNF、β-EP对单胺类神经递质水平也有一定的影响。脑室内注射细胞因子可降低大鼠额叶皮质5-HT含量,中脑和纹状体内5-HT及其代谢产物5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)都减少[38]。BDNF的下调可增加海马神经元对伤害性应激的敏感性,引起神经毒性从而导致海马神经元的萎缩甚至死亡[39],间接对单胺类神经递质产生影响;向小鼠脑室注入β-EP能增加体内5-HT的含量[40]。本研究发现L-茶氨酸和GABA联合干预后,大鼠血清、脑组织中IL-6水平降低,BDNF、β-EP升高。IL-6炎症反应降低可能影响5-HT系统受损修复。神经元、神经胶质细胞分泌BDNF增加降低神经毒性可能对5-HT、DA的合成产生影响,其免疫保护作用也影响了细胞因子IL-6的水平。β-EP含量升高可能影响5-HT的含量,降低促炎症性细胞因子IL-6的水平。L-茶氨酸和GABA可通过影响IL-6、BDNF、β-EP水平,增加大鼠体内单胺类神经递质浓度。

前人研究中L-茶氨酸、GABA对慢性应激大鼠抗抑郁的相关实验应用的剂量远高于本研究,且为单一成分[13,21]。检验指标只限于脑组织中单胺神经递质水平[13],或GABA受体和免疫阳性细胞数量[21]。本研究从大鼠体重增量、糖水偏好程度、旷场实验行为学方面和大鼠血清、脑组织中神经递质含量,体内神经营养因子及炎症水平多个角度探索L-茶氨酸和GABA联合作用机制验证其对抑郁症状的有效缓解作用,发现L-茶氨酸和GABA联合干预对CUMS诱发的抑郁症有一定改善作用,且高剂量的作用更为显著,作用机制可能为两者联合增加大鼠体内单胺类神经递质浓度,升高BDNF、β-内啡肽含量,降低炎症水平来发挥抗抑郁作用。