响应面法优化偃松松仁蛋白肽乳饮料的制备工艺

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(1.东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨 150040; 2.黑龙江省森林食品资源利用重点实验室,黑龙江哈尔滨 150040)

偃松(Pinuspumila)属松科(Pinaceae)松属(PinusLinn),形态为灌木状,树干通常伏卧地面,呈匍匐状生长,高3～6 m,是一种慢生树种。偃松分布范围广泛,在我国集中分布在大兴安岭北部山地森林,是全国保存完好,面积较大的原始林区[1]。偃松仁属中性种仁,富含多种营养物质,具有很高的营养价值,其中100 g松仁中含脂肪70.6 g,蛋白质13.4 g,钙、铁、锌、胡萝卜素等多种维生素和矿物质，还含有多种氨基酸,包含人体必需的8种氨基酸,比例适中[2]。松仁性温味甘,具有养阴、息风、润肺、滑肠等功效,可治疗风痹、头晕、燥、咳、吐血、便秘等症[3]。

研究表明,植物蛋白寡肽比氨基酸更易、更快通过小肠粘膜被机体吸收利用[4],而且具有降血压、抗氧化、提高免疫力等多种生理功能[5-6]。因此,植物蛋白肽成为国内外学者的研究热点,其中植物蛋白肽饮料尤为重要。于晓平等[7]利用碱性蛋白酶水解香菇,制备香菇肽乳饮料,为食用菌在液态乳饮料生产中的应用提供参考。苗文娟等[8]以大米肽为主要原料开发大米肽饮料,使其具有大米的低致敏性、易消化和易吸收等特点,同时具有多肽的特殊风味,这种新型大米肽精深加工产品,既提高资源利用率又丰富了食品市场。王端[9]以葛根和核桃饼粕为原料,选用乳酸菌发酵,同时通过酶解法制备核桃多肽,不仅丰富了饮料的种类,还提高了产品的附加值,符合新型功能性营养食品的发展方向。刘政[10]采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶同加的方法将南瓜籽粕蛋白酶解制备短肽开发低肽饮料,制得的饮料酸甜适口,奶味纯正,有很好的市场发展前景。但从文献来看,蛋白肽饮料的配方和工艺对产品稳定性影响的研究少有报道,尤其是对偃松松仁蛋白肽饮料的研究更未见报道。

本试验以偃松松仁蛋白为原料,利用蛋白酶水解制备偃松松仁蛋白肽溶液。采用单因素和响应面优化偃松松仁蛋白肽饮料的制备工艺,以稳定性和感官评价为指标。旨在为植物蛋白肽饮料市场提供新产品,同时为进一步开发偃松资源和带动林区经济发展提供科学研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

偃松仁 内蒙古阿龙山林业局提供;Alcalase碱性蛋白酶 诺维信生物技术有限公司;乳粉 青岛智冠乳业有限公司;柠檬酸 西安裕华生物科技有限公司;绵白糖 山东永泰糖业有限公司;羧甲基纤维素 佛山市富实新高分子纤维有限公司;黄原胶 河南旗诺食品配料有限公司。

722S可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;TDL-40B-W离心机 湖南星科科学仪器有限公司;VBR80手持糖量计 上海医联控温仪器厂;MJ-180BS-2恒温培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司;DFT-250A中药粉碎机 上海迈上科学仪器有限公司;FM300-S-S 高剪切分散乳化机 上海沐轩实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 偃松仁蛋白的制备 参考文献[11]并稍作修改,将偃松松子去壳除衣,在40 ℃的干燥箱中处理24 h,粉碎,过60目筛,与石油醚1∶25比例在60 ℃的条件下脱脂8 h,重复3次,得脱脂偃松仁粉。称取一定量偃松仁粉按1∶30 (w/v)的料液比加入蒸馏水混合均匀,用1 mol/L NaOH调节pH至9.2,在45 ℃,500 W的超声功率下,处理65 min,将提取液在4000 r/min条件下离心20 min后取上清液,用1 mol/L HCl调节pH至4.6沉淀蛋白,后在4000 r/min条件下离心20 min取沉淀,加1 mol/L的NaOH溶液调pH7.0,后真空冷冻干燥,得偃松仁蛋白。

1.2.2 偃松松仁蛋白肽饮料制备的单因素实验 参照文献[12]并稍作修改,准确称取3 g偃松仁蛋白粉,加入100 mL蒸馏水搅拌均匀,于90 ℃水浴15 min,再冷却至45 ℃,用0.6 mol/L 氢氧化钠调节pH至10,加入7000 U/g Alcalase碱性蛋白酶,酶解3 h,于100 ℃水浴中灭酶5 min,然后经过4000 r/min离心20 min,得到偃松松仁蛋白水解液。

分别取一定量柠檬酸(0.05%、0.08%、0.10%、0.12%、0.15%)和绵白糖(2%、4%、6%、8%、10%)、羧甲基纤维素与黄原胶比例为1∶1的复合稳定剂(0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%),充分混合并搅拌均匀,缓慢加入一定量的45 ℃温水,沿同一方向搅拌使其充分溶解,然后加入一定量全脂乳粉(1%、2%、3%、4%、5%),充分搅拌溶解,最后加入偃松松仁蛋白水解液(10%、15%、20%、25%、30%),充分混合后在均质压力为30 MPa的条件下进行均质(2、3、4、56次/s),均质好的料液经玻璃瓶定量灌装、封盖后,在90 ℃条件下灭菌10 min,后冷却至室温,得到偃松松仁蛋白肽乳饮料。柠檬酸添加量、绵白糖添加量、复合稳定剂添加量、全脂乳粉添加量、偃松松仁蛋白水解液添加量和均质次数的固定水平分别为0.10%、6%、0.2%、3%、20%和均质2次/s,在对各因素进行单因素试验探究时,其他因素均取固定水平,研究各单因素对感官评分和离心沉淀率的影响。

1.2.3 Plackett-Burman试验设计联用Box-Behnken响应面法优化饮料工艺 在单因素试验的基础上,通过Plackett-Burman试验分别确定对偃松松仁蛋白肽乳饮料的感官评分和离心沉淀率影响显著的因素,然后分别以感官评分和离心沉淀率为评价指标,采用中心组合Box-Benhnken Design(BBD)设计试验进行响应面优化偃松松仁蛋白肽乳饮料制备工艺。根据PB试验分别针对感官评分和离心沉淀率评价指标筛出显著因素进行响应面中心组合试验,响应面试验设计分别见表1和表2。

表1 以感官评分为指标的响应面试验因素与水平设计Table 1 Box-Behnken design test factor and level design by sensory evaluation standard

表2 以离心沉降率为指标的响应面试验因素与水平设计Table 2 Box-Behnken design test factor and level design by centrifugal sedimentation rate

1.2.4 偃松仁蛋白含量的测定 参考GB/T 5009.5-2016方法,测定偃松松仁蛋白的含量。

表3 偃松仁蛋白肽乳饮料感官品质评分标准Table 3 Sensory quality evaluation standard of peptide milk beverage of Pinuspumila nuts

1.2.5 偃松仁蛋白水解度的测定 采用pH-stat法[13],测定蛋白质水解度,偃松仁分离蛋白的水解度DH,根据酶解过程中用自动电位滴定仪控制滴定NaOH,保证酶解过程中酶解液pH恒定,记录消耗的NaOH的量,计算公式:

式中,DH:水解度;VNaOH:氢氧化钠消耗体积mL;CNaOH:氢氧化钠浓度mol/L;α:氨基解离常数;MP:底物中蛋白质总质量g;Htot:底物中蛋白质肽键总数mmol/g,pK:取7.0为平均值计算。

1.2.6 偃松松仁蛋白肽乳饮料稳定性的测定 采用离心沉淀法[14],在离心管中准确加入15 mL偃松仁蛋白肽乳饮料,然后4000 r/min离心15 min,弃去上部溶液,准确称取沉淀物质量,计算沉淀率。

1.2.7 偃松松仁蛋白肽乳饮料感官评价 参照Smit[15]的方法,邀请食品科学与工程专业的老师和同学组成10人的(男∶女=1∶1)评价小组,分别从色泽、风味、滋味、组织状态四个方面对产品的感官品质进行评分,其评分标准见表1。

1.3 数据处理

每组3个平行,结果取平均值。数据结果以平均值±标准方差(means±SD)表示,数据处理,结果采用统计分析软件SPSS 21.0与Origin 9.0进行统计分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 水解度的测定

脱脂偃松松仁粉中的蛋白质含量测得结果为(41.5±1.43) g/100 g,经过水解后采用pH-stat法测定蛋白质水解度,偃松松仁分离蛋白的水解度DH,根据酶解过程中用自动电位滴定仪控制的NaOH,保证酶解过程中酶解液pH恒定,记录消耗的NaOH的量,最终测得的水解度为15.48%±0.97%。

2.2 偃松松仁蛋白肽乳饮料的研究

2.2.1 柠檬酸添加量对偃松松仁蛋白肽乳饮料品质的影响 柠檬酸调节饮料的pH,赋予产品温和爽净的酸味,增强食欲和促进钙、磷的吸收,防腐抑菌作用,延长产品货架期[19]。柠檬酸添加量对肽乳饮料的影响如图1所示,柠檬酸添加量在0.05%～0.12%范围内,随着柠檬酸添加量的增加,偃松松仁肽乳饮料感官评价明显升高,此时饮料酸甜适中、口感舒畅。当柠檬酸添加量大于0.12%时感官评分降低,酸甜失调,不适口,这可能由于当柠檬酸添加到一定量后,酸度变大,风味变差。因此当添加量为0.12%时,偃松松仁蛋白肽乳饮料口感最佳,糖酸度协调,易被接受。

图1 柠檬酸添加量对感官评定和离心沉降率的影响Fig.1 Effects of citric acid addition on sensory evaluation and centrifugal sedimentation rate

随柠檬酸添加量增加,饮料的离心沉淀率呈先下降后上升的趋势。这是由于当溶液pH与蛋白质等电点越接近,溶液的溶解度也越小,蛋白质分子也越易和溶液内其余组分彼此聚集凝结,形成析出物。当溶液pH与蛋白质的等电点越偏离时,其水合作用越好,蛋白质也越容易解离成亲水胶体,其溶解度也随之增大,溶液稳定更好[20]。

2.2.2 绵白糖添加量对偃松松仁蛋白肽乳饮料品质的影响 绵白糖主要成分为蔗糖,含有少量转化糖,口感纯净,风味优于白砂糖。绵白糖不仅可以改善甜味,还可以赋予产品特殊风味[21]。由图2可知,随着绵白糖添加量的增加,饮料的感官评价分数呈先上升后下降的趋势,当绵白糖添加量6%时,偃松仁蛋白肽乳饮料的感官评分达到最高分76分,甜度适中。这由于当绵白糖添加量过高时,会影响偃松松仁蛋白肽特有风味,增加产品成本;添加量较少时,偃松松仁肽乳饮料甜度偏低,风味寡淡。

图2 绵白糖添加量对感官评定和离心沉降率的影响Fig.2 Effects of soft sugar addition on sensory evaluation and centrifugal sedimentation rate

随着绵白糖添加量的增加,饮料的离心沉淀率出现先下降后上升再下降的趋势。这是由于绵白糖添加量的增加时,溶液的浓度也随之改变。当液体浓度保持恒定,有利于胶体溶液维持稳定。当溶液浓度改变时,蛋白质粒子就会慢慢相互凝聚,使絮状沉淀物出现。

2.2.3 复合稳定剂添加量对偃松松仁蛋白肽乳饮料品质的影响 稳定剂是维持饮料稳定性的重要因素,是影响饮料组织状态分层现象的关键。复合稳定剂比单一稳定剂具有更好的稳定效果[22],本实验所用复合稳定剂为CMC和黄原胶1∶1复配。由图3可知,随着复合稳定剂添加量的增加,饮料感官评价分数随之增加,当添加量为0.20%时,感官评价分数达到最高为82分,此时偃松松仁肽乳饮料口感、柔和细腻、无分层。当添加量超过0.20%时,饮料的感官评分呈下降趋势,这是由于复合稳定剂的添加量过大,会稀释饮料本身的乳香味和偃松仁蛋白水解液饮料特有的香味,使得感官评价分数降低。

图3 复合稳定剂添加量对感官评定和离心沉降率的影响Fig.3 Effects of compound stabilizer dosage on sensory evaluation and centrifugal sedimentation rate

当复合稳定剂的添加量增加时,饮料的离心沉降量呈先下降后升高的趋势。当复合稳定剂添加量为0.20%时,饮料的离心沉降率最低为2.9%,这可能由于复合稳定剂可使分散介质粘度增加,以防液滴并合,使颗粒沉降速率降低,减少分子间的凝聚,从而使乳浊液中的分散粒子稳定,使植物蛋白质饮料的稳定性提高。当复合稳定剂添加量过高时会使溶液变得更加粘稠,出现絮状物,因此影响饮料的稳定性。

2.2.4 乳粉添加量对偃松松仁蛋白肽乳饮料品质的影响 乳粉添加量对肽乳饮料的影响如图4所示,随着乳粉的添加量的增加,其感官评分呈先上升后下降的趋势,当乳粉添加量为2%时感官最佳评分为86分,此时偃松仁蛋白水解液特有香味与乳香味二者协调,乳粉添加量在1%～2%时,随着乳粉添加量的增加,乳粉香味渐强,饮料感官评分增加,当乳粉添加量在2%～5%时,奶香较浓使得饮料的感官评分降低。

图4 乳粉添加量对感官评定和离心沉降率的影响Fig.4 Effects of milk powder addition on sensory evaluation and centrifugal sedimentation rate

随着乳粉的添加量的增加,饮料的沉淀离心率呈先减小后上升的趋势,乳粉添加量为2%,离心沉淀率为3.24%,此时乳饮料色泽均匀一致、口感柔和,组织均匀无分层现象。乳粉添加量在1%～2%时,离心沉淀率降低,当乳粉添加量在2%～5%时开始上升,因为随着乳粉添加量的增加,饮料变得粘稠,离心沉淀率增加[17-18]。

2.2.5 偃松松仁蛋白水解液添加量对肽乳饮料品质的影响 偃松松仁蛋白水解液添加量对肽乳饮料的影响如图5所示,在添加量为小于20%时,偃松仁蛋白水解液风味不明显,随着添加量增加感官评价分数上升,在添加量为20%时达到最大值92分,比偃松仁蛋白水解液添加量为10%时感官评分增加了29.57%。此时饮料呈现偃松仁蛋白肽特有的香气,色泽均一,当偃松仁蛋白水解液的添加量大于20%,颜色变深,苦味明显,饮料的感官评价分数开始减小,这可能由于当偃松仁蛋白水解液添加量到达一定的量后,其残留苦味的作用更加明显,使得风味变差。

图5 偃松仁蛋白水解液添加量 对感官评定和离心沉降率的的影响Fig.5 Effects of adding protein hydrolysate of Pinuspumila seed on sensory evaluation and centrifugal sedimentation rate

饮料的离心沉淀率越小,说明饮料稳定性越好[16]。饮料离心沉淀率随松仁蛋白水解液添加量升高而减小,稳定性升高,在添加量为20%时达到最小值为1.66%,当添加量大于20%时,随着偃松松仁蛋白水解液添加量升高，饮料离心沉淀率开始增加,稳定性降低,组织不均匀,这是由于大量加入偃松仁蛋白水解液后,饮料组织状态不均匀,出现沉淀,分层现象严重。

表4 Plackett-Burman试验设计及结果Table 4 Results of Plackett-Burman experimental design

表5 Plackett-Burman试验方差分析结果Table 5 Results of Plackett-Burman variance analysis

2.2.6 均质次数对偃松松仁蛋白肽乳饮料品质的影响 将饮料用高剪切分散乳化机进行均质,由图6可知,随着均质次数的增加饮料的感官评分随之上升,在均质次数达到4次/s时感官评价分数达到最高值为78分,当均质次数大于4次/s时,饮料的感官评价分数随之下降。这可能由于随着均质次数的增加,饮料更加均匀,口感细致,使得感官评价分数增加。均质次数过多时会破坏饮料成分结构,致使饮料的风味变差。

图6 均质次数对感官评定和离心沉降率的影响Fig.6 Effect of homogenization frequency on sensory evaluation and centrifugal sedimentation rate

由图6可知,随着均质次数的增加,饮料的离心沉降率降低。当均质次数为4次/s时,饮料的离心沉降率为2.8%。当均质次数大于4次/s时,饮料的离心沉降率缓慢下降,降低幅度较小。可以看出均质次数越多,偃松松仁蛋白肽饮料中固形物粒径越小越均匀,根据沉降定律可知饮料就越稳定,即离心沉降率越低。但是当均质次数越多,饮料中固形物粒径减小幅度越小,所以饮料的离心沉降率下降越缓慢。

2.3 响应面法优化配方实验

2.3.1 以偃松仁蛋白肽乳饮料感官评价为考察指标的响应面优化试验 采用Plackett-Burman试验对影响因素进行显著性分析,试验设计和方差分析结果见表4和表5。

由表4和表5可以看出各因素对偃松松仁肽乳饮料感官评价影响强弱顺序为:偃松松仁蛋白质水解液添加量>乳粉添加量>绵白糖添加量>柠檬酸添加量>复合稳定剂添加量>均质次数,因此试验选取水解液添加量、乳粉添加量、绵白糖添加量三个因素进行响应面优化试验,以偃松松仁肽乳饮料感官评分为考察指标,利用Box-Behnken建立四因素三水平数学模型,响应面试验设计及结果见表6和表7。

表6 Box-Behnken试验设计及结果Table 6 Test design and results of Box-Behnken

采用Design-Except 8.05软件对表6试验数据进行多元回归拟合,获得的感官评价(Y)对绵白糖添加量(A)、偃松松仁蛋白质水解液添加量(B)、乳粉添加量(C)真实值的回归模型方程为:Y=81.80-1.25A+1.88B-0.38C-2.50AB-3.00AC-2.25BC-6.03A2-9.28B2-8.77C2。

表7 回归方程系数显著性检验Table 7 Significant test of coefficient of regression equation

由表7可知模型的P值小于0.01,表明该响应面回归模型达到极显著水平,失拟项不显著(P=0.68),说明该模型对本试验拟合程度较好。回归方程的决定系数R2为0.9604,说明该模型对实验点的适配度达到96.04%,具有较高的拟合度,因此可以利用该模型预测上述提取条件对偃松仁蛋白肽乳饮料感官评定的影响。由方差分析结果可知,偃松松仁蛋白水解液对偃松松仁蛋白肽乳饮料的感官评分影响最大,其次是绵白糖的添加量,影响最不显著的是乳粉添加量。同时从表7中可以看出,模型中一次项A、B、C和交互项AB、BC对偃松仁蛋白肽乳饮料感官评分影响不显著,而交互项中AC对偃松仁蛋白肽乳饮料感官评分有显著影响,二次项A2、B2、C2对偃松仁蛋白肽乳饮料感官评分均有极显著的影响。

2.3.2 以偃松仁蛋白肽乳饮料稳定性为考察指标的响应面优化试验 采用Plackett-Burman试验对影响因素进行显著性分析,试验设计和方差分析结果见表8和表9,由于离心沉淀率取最小值。所以各因素对偃松松仁肽乳饮料感官评价影响强弱顺序为:均质次数>乳粉添加量>水解液添加量>柠檬酸添加量>复合稳定剂添加量>绵白糖添加量。

表8 Plackett-Burman试验设计及结果Table 8 Results of Plackett-Burman experimental design

表9 Plackett-Burman试验方差分析结果Table 9 Results of Plackett-Burman variance analysis

试验选取均质次数、乳粉添加量、偃松松仁蛋白质水解液添加量三个因素进行响应面优化试验,以偃松松仁肽乳饮料感官评分为考察指标,利用Box-Behnken建立四因素三水平数学模型,响应面试验设计及结果见表10和表11。

表10 Box-Behnken试验设计及结果Table 10 Test design and results of Box-Behnken

2.4 模型的验证

在单因素实验研究结果为柠檬酸添加量为0.12%、复合稳定剂添加量为0.2%、均质次数为4次/s条件下,对以感官评分为评价指标通过响应面设计优化的偃松松仁蛋白水解液添加量20.6%、乳粉添加量1.99%、绵白糖添加量5.75%进行验证试验,在此条件下验证结果为感官评分为81.99。而在单因素试验研究结果为柠檬酸添加量为0.12%、复合稳定剂添加量为0.2%、绵白糖添加量为6%条件下,对以离心沉降率为评价指标通过响应面设计优化的均质次数为3.69次/s、偃松松仁蛋白水解液添加量为19.36%和乳粉添加量为1.92%进行验证试验,在此条件下验证结果为离心沉降率预测值为0.42%。结合实际生产需要,将偃松仁蛋白肽乳饮料的各因素添加量调整为:偃松松仁蛋白水解液添加量20%,乳粉添加量2%,绵白糖添加量6%,均质次数4次/s,复合稳定剂添加量0.2%,柠檬酸添加量0.1%时,此条件下得出感官评价分数为82分,离心沉降率为0.58%。

表11 回归方程系数显著性检验Table 11 Significant test of coefficient of regression equation

3 结论

通过pH-stat法测定蛋白质水解度为15.48%;通过单因素试验和响应面优化试验确定了偃松仁蛋白肽乳饮料的最佳工艺条件为水解液添加量20%、乳粉添加量2%、绵白糖添加量6%、均质次数4次/s、柠檬酸添加量0.1%、复合稳定剂添加量0.2%。感官评价分数为82分,稳定性为0.58%。其偃松仁蛋白肽乳饮料色泽佳、组织均匀、乳脂香味适中,具有独特风味。

将偃松仁蛋白肽应用于乳饮料的生产,提高了产品的营养价值,且能够充分利用偃松资源,延长产业链,实现偃松资源的高值化利用,具有一定的经济效益和社会效益。