天津七里海野生苇蘑菌株继代培养基的筛选

李 倩 李舒婷 王润楠 于水欣 刘 江 刘西周

（天津师范大学生命科学学院，天津300387）

苇蘑为蜡伞科（Hygrophoropsidaceae）、拟蜡伞属（Hygrophoropsis）的一种蘑菇[1]，目前仅被发现生长于天津市宁河区七里海湿地的芦苇荡中，是该区域内一种特有的珍稀野生食用菌[2]。七里海是天津平原残留的众多泻湖之一，位于天津市东北部宁河区，1992年10月国务院在此建立“天津古海岸与湿地国家级自然保护区”[3]。该地区的芦苇丛多年败叶腐草厚积，盛夏时节雨水较多，形成了适合于苇蘑生长的底质、湿度、温度和光照环境[1]。腐烂的芦苇地下茎间仍有良好的通气孔隙，足以供给菌丝生长所需的氧气，因此苇蘑可以生长在地下数十厘米处的腐烂芦苇腐殖质中[4]。人们采集苇蘑后，或鲜食，或晒干食用，口感独特、营养丰富，味道鲜美而独特，远胜于其他蘑菇[1]。近年来，天津七里海地区生态环境被破坏，湿地退化严重，再加上人为地过度采摘，野生苇蘑的产量和品质逐年降低，野生苇蘑几乎绝迹。

图1 野生苇蘑子实体

为保护苇蘑这一独特的生物资源，多年来很多学者一直在研究人工栽培苇蘑技术，目前仅见天津师范大学生命科学院关于天津市七里海野生苇蘑人工驯化成功的报道[5]。在实验室苇蘑菌株通常保藏在PDA综合培养基上，然而传代次数越多，对菌种的创伤就越大[6]，并且易造成菌种退化[7]。查阅国内外资料，目前关于苇蘑的仅有科属研究[1]、液体培养菌种的优化[8-10]、苇蘑多糖提取工艺研究[11]、不同活性抗氧化活性作用研究[12]、人工驯化成功相关报道[5]。目前还未见关于苇蘑菌株退化、老化问题研究报道。笔者结合苇蘑的自然生长条件，将稻草、稻草（浸提液）和芦苇腐殖质这3种天然成分作为研究因素，通过单因素与正交试验，优化出了一种适合苇蘑菌株继代培养的培养基，为苇蘑进一步批量生产与驯化研究提供理论和实践支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

苇蘑子实体（采自天津七里海，现保存于天津师范大学蕈菌研究所）、稻草粉、稻草（浸提液）、芦苇腐殖质；马铃薯（浸提液）、葡萄糖、MgSO4·7H2O、KH2PO4、琼脂粉、VB1。

1.2 培养基

1.2.1 PDA综合培养基

马铃薯（浸提液）200 g/L，葡萄糖 20 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO43 g/L，琼脂粉20 g/L，VB10.01 g/L

1.2.2 不同稻草粉、稻草（浸提液）、芦苇腐殖质培养基

以PDA综合培养基为基础，分别加入稻草粉、稻草（浸提液）、芦苇腐殖质作为试验培养基，具体见表1。

表1 供试培养基配比 g/L

1.3 试验方法

1.3.1 不同含量稻草粉、稻草（浸提液）、芦苇腐殖质单因素试验

将苇蘑子实体通过组织分离获得菌种接种到PDA综合培养基中，29℃培养20 d后，选取苇蘑菌落边缘生长点部位，用直径为1 cm的打孔器取苇蘑菌丝块，分别接种到20种培养基和对照培养基（PDA综合培养基）中，每种培养基做3个重复。29℃培养29 d，采用十字交叉法每隔三天测量菌落直径[5]，并观察记录菌落褐变、老化的程度。

1.3.2 正交设计优化培养基配方试验

大多数食用菌能在PDA综合培养基上正常生长，但是PDA综合培养基的营养丰富，保藏过程中尽量选择使用营养相对贫瘠的培养基[13]，因此将稻草粉、稻草（浸提液）、芦苇腐殖质和PDA综合培养基中的葡萄糖含量作为四个因素，根据单因素的梯度筛选试验结果，设计正交试验（表2），试验方法同单因素试验。通过正交试验结果分析，得到理论最佳继代培养基配方，并进行验证。

表2 培养基配方优化正交试验设计 g/L

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同稻草粉含量培养基中苇蘑菌落大小及菌丝老化程度

由表3可见，培养至第12天稻草粉5 g/L培养基中苇蘑菌丝菌落直径最大，同时其菌落未出现褐变和老化现象。

表3 稻草粉含量对苇蘑菌落大小（直径）的影响

2.1.2 稻草（浸提液）含量培养基中苇蘑菌落大小及菌丝老化程度

由表4可见，培养至第12天稻草（浸提液）50 g/L培养基中苇蘑的菌落直径最大，同时其菌落没有出现老化、褐变现象。

表4 稻草（浸提液）含量对菌落大小（直径）的影响

2.3 不同芦苇腐殖质含量培养基中苇蘑菌落大小及菌丝老化程度

由表5可见，培养至第12天芦苇腐殖质10 g/L培养基中的苇蘑菌落直径最大，同时菌落未现老化。

表5 不同芦苇腐殖质含量对苇蘑菌落大小（直径）的影响

2.2 正交试验

正交试验结果见表6。由表6可见，影响菌丝体生长的最重要因素是培养基中葡萄糖含量，其次是稻草（浸提液），稻草粉，芦苇腐殖质；1号培养基、4号培养基和5号培养基的菌落直径都达到了6 cm以上，其中5号培养基的菌落直径最大。

表6 培养基配方优化正交试验结果

由图2可见，第15天时，4号培养基和5号培养基的菌落都已经出现了老化现象，而1号培养基的菌落仍然是白色且没有出现任何老化的现象。因此，正交试验结果表明，最适合苇蘑菌丝体生长的是1号培养基即葡萄糖10 g/L，马铃薯（浸提液）200 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO43 g/L，琼脂粉20 g/L，VB10.01 g/L，稻草粉 2.5 g/L，稻草（浸提液）25 g/L，芦苇腐殖质5 g/L。正交试验中理论上的最佳培养基配方是A2B1C2D1，即葡萄糖10 g/L，马铃薯（浸提液）200 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO43 g/L，琼脂粉 20 g/L，VB10.01 g/L，稻草粉 5 g/L，稻草（浸提液）25 g/L，芦苇腐殖质10 g/L。

图2 培养基配方优化正交试验第15天菌落

通过验证，理论最佳培养基第15天菌落直径如表7所示，结果表明，正交试验的最优培养基1号培养基和理论最佳培养基的菌落直径相近。

表7 正交试验理论最佳培养基的菌落直径

由图3可知，理论最佳培养基在第15天时菌落呈白色，出现了少量菌核，菌核是真菌菌丝在不良环境条件下经无性繁殖形成的一种致密而坚硬的组织结构，是真菌的营养贮藏和休眠器官[14]。而1号培养基的菌落在15 d时为白色且菌丝致密，并未出现老化现象，推测可能与培养基中营养相对贫乏有关，因此苇蘑菌株在1号培养基上生长优于理论最佳培养基。

培养至39 d，九种培养基的菌落如图4所示，菌丝都已长满平板，3号、4号、6号和8号培养基上的菌落由中心向外出现了褐变现象且出现了较多菌核，这表明这四种培养基不适合苇蘑实验室日常的保种；1号、2号、5号、7号和9号培养基上的菌落呈现白色，2号、5号、7号和9号培养基中的菌落有老化现象。

图3 正交试验1号培养基和理论最佳培养基第15天菌落对比

图4 培养基配方优化正交试验第39天菌落对比

由图5可见，培养至39 d时，理论最佳培养基中的菌落出现了大量菌核，而1号培养基中的菌落仍然为白色且未出现菌核。苇蘑菌丝体在传统的PDA综合培养基上生长至39 d时，菌落出现了大量菌核并且已经褐变和老化，表明1号培养基克服了苇蘑菌丝体不能较长时间继代保藏的问题，方便实验室苇蘑菌丝体的日常继代保种。

3 小结

试验结果表明最适合苇蘑菌丝体日常继代保种的培养基配方是葡萄糖10 g/L，马铃薯（浸提液）200 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO43 g/L，琼脂粉20 g/L，VB10.01 g/L，稻草粉 2.5 g/L，稻草（浸提液）25 g/L，芦苇腐殖质5 g/L。该培养基29℃培养苇蘑39 d，未出现菌丝老化褐变现象。

图5 正交试验1号培养基和理论最佳培养基第39天菌落对比

与其他试验最大的不同是在培养基中加入了天然成分，初步解决了实验室无法较长时间继代保藏苇蘑菌株且易老化的问题，优化出一种在实验室环境中适合苇蘑菌丝生长的继代培养基配方，为苇蘑菌株的继代培养和菌株保藏、深入研究以及规模化培养提供了保障。