非编码RNA与肝细胞癌相关性的研究进展

唐玉莲，李根亮，倪安妮

(右江民族医学院生物化学与分子生物学教研室，广西 百色 533000)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是目前临床上一种常见的恶性肿瘤，是世界上第三大常见癌症死亡原因[1]，对人们的身体健康造成了严重威胁。近年来，随着治疗水平的不断提高，HCC的治疗效果虽不断改善，但患者5年生存率仍然普遍较低[2]。随着医学表观遗传学的不断兴起和高通量测序技术的发展，非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)已经成为当今肿瘤研究的热门方向。非编码RNA包括与PIWI蛋白相互作用的RNA(piRNA)、微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、环状RNA(circRNA)以及小干扰RNA(siRNA )，它们在细胞的生命调控过程中扮演着十分重要的角色，参与HCC的发生、进展、结局等各个病理过程，与HCC细胞的分化、增殖等密切相关。下面本文就近年来HCC中的几种ncRNA的研究进展进行简要综述，以期为今后HCC中ncRNA的研究提供一定的思路和帮助，为防治HCC提供好的策略。

1 piRNA

1.1 piRNA的概念及功能 piRNAs是近些年新发现的一类小非编码RNA，长度为26～33 nt。其主要与PIWI蛋白相互作用，表达于生殖细胞当中，对生殖干细胞分化、胚胎发育、基因转录以及转录后的修饰等起重要调控作用[3]。2006年Aravin A等[4]在对小鼠睾丸中ncRNA编码时，于雄性小鼠生殖细胞中发现piRNA。因发现其主要与PIWI蛋白相互作用，故称之为PIWI-interacting RNA，简称piRNA。piRNA与PIWI蛋白结合后形成的piRNA复合物可识别、结合mRNA，导致mRNA基因沉默或降解，调控生殖细胞的增殖与分化。

1.2 piRNA与HCC发生、发展、预后的关系 随着对piRNA研究的不断深入，不仅在正常的睾丸组织和造血干细胞中发现piRNA/PIWI大量表达，其在许多肿瘤组织和细胞中均有明显的异常表达[5]。比如在胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌中，恶性程度与PIWI表达量明显呈正比，表达水平越高，恶性程度越严重，并且其预后也越差。piRNA除了参与上述肿瘤外，还参与了肝癌以及肝纤维化的发生、发展。2016年Rizzo F等[1]研究了肝硬化和不同进展阶段肝癌中特有的piRNA表达特征，在肝硬化和HCC组织样本中分别鉴定出601个和753个piRNAs，发现piRNA可参与HCC血管生成过程的调控。缪沛真等[6]通过小RNA二代测序和生物信息学手段，亦发现在HCC癌组织和癌旁组织中、转移性和非转移性HCC组织中存在大量差异表达的piRNA，对这些差异表达的piRNA的GO和KEGG通路进行分析后结果显示，其可能通过参与细胞黏附等调控HCC的转移过程。随着对HCC组织中piRNA作用机制探讨的不断深入，研究者进一步发现piRhep1水平与HCC浸润转移呈正相关，piRhep1可通过调节AKT磷酸化，促进HCC恶化等[7]；PIWI的亚型——PIWIL2与piRhep1还呈明显的正相关：过表达piRhep1、PIWIL2可激活PI3K/AKT分子信号通路，促进HCC细胞增殖与转移；而敲低piRhep1后，HCC细胞的增殖能力、侵袭力会下降或减弱。另还有研究发现，piR-823除了促进多发性骨髓瘤及结直肠癌中癌细胞增殖外，在肝硬化、肝癌前病变、肝细胞癌中表达都异常升高，piR-823在肝纤维化中可通过翻译起始因子EIF3B，启动TGF-β1翻译促进肝星状细胞活化，从而促进肝纤维化发生[8]。此外也有报道，于多种肿瘤组织如肺癌、HCC等上调表达的三种piRNA，即DQ599147、DQ593292和DQ590670，可通过组胺及其受体参与HCC的恶性进展，实现对HCC的调控作用[9]。另还有研究报道，piRNA及PIWI家族蛋白在HCC中都具有类似癌基因的作用，在HCC中高表达的piRNA及PIWI家族蛋白与HCC的分化程度、瘤体直径、肝内转移密切相关[10]。

2 miRNA

2.1 miRNA的概念及功能 miRNAs是一类小的非编码RNA，可与靶基因mRNA结合，通过诱导沉默复合体(RISC)形成，阻止mRNA翻译或降解mRNA，作为抑癌基因或癌基因参与肿瘤的发生、发展。miRNAs通过靶向作用于编码基因既可以促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，也可抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移。

2.2 miRNA 参与肝细胞癌的发生、发展与迁移 Lu YJ等[11]研究发现，miR-1470在HCC癌组织中高表达，高表达的miR-1470具有促进HCC细胞增殖、抑制HCC细胞凋亡的作用。Kong QL等[12]研究揭示，与癌旁的健康组织相比，lncRNA MIR4435-2HG和miRNA-487a在HCC癌组织中高表达，且高表达的MIR4435-2HG能通过上调miRNA-487a促进HCC癌细胞增殖，Hu JH等[13]也发现一种在乳腺癌、恶性黑色素瘤和胰腺癌等肿瘤中都失调表达的miRNA-301-3p，它通过对VGLL4的靶向调控，抑制HCC的发展，而高表达的miR-301a-3p使HCC细胞系对化疗抵抗能力、增殖能力、侵袭能力明显增强。

而Liu FH等[14]研究发现的则是，miRNAs作为抑癌基因存在于HCC，他们的研究结果揭示miR-1297可通过靶向EZH2抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡。此外，miR-627-5p也具有抑癌作用，它通过对BCL3抑制而发挥作用，其在肿瘤直径>5cm或晚期(Ⅲ期+Ⅳ期)的HCC组织中表达明显降低；而高表达miR-627-5p可显著抑制Hep3B和SMMC-7721肝癌细胞株的增殖，并阻滞G1期细胞和诱导其凋亡[15]。另Turato C等[16]研究也发现了一些miRNAs，如miR-122、miR-221、miR-1和miR-21等对细胞的周期调控起明显的抑制作用，细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等等均受到明显影响。还有在3种肝癌细胞系(HepG2、SMMC-7721和Huh7)中均异常表达的miR-206，被报道可减弱HCC细胞活力、侵袭和迁移，并通过cMET基因的3′-UTR为沉默靶点发挥抑癌作用[17]。还有miR-663a也是如此，其通过靶向抑制HMGA2也抑制了HCC增殖和运动[18]。

此外，随着微阵列技术的发展，Mou T等[19]还利用基因芯片数据集及生物信息学分析技术，分析了HCC中的mRNA和miRNA谱，鉴定出了大量差异表达的miRNA，其中上调58个miRNAs和下调6个miRNAs。上调的miRNAs主要富集于细胞分裂体和染色体分离体中，下调的miRNAs主要参与了补体级联式的酶原激活、羧酸代谢等过程，以及免疫反应和氧化代谢等过程。可见，miRNAs通过多种细胞途径参与HCC的发生、发展与转移。

3 lncRNA

3.1 lncRNA的概念及功能 长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA) 是一类长度大于200 nt，无编码蛋白质功能的RNA分子。与mRNA一样，lncRNA定位于特定细胞区，具有特定的生物学功能。核定位的lncRNA可以作为染色质修饰复合物[20]或转录因子[21]，而细胞质中的lncRNA通常通过直接控制mRNA的稳定性[22]或通过充当所谓的竞争性内源RNA(ceRNA)而起到蛋白质水平调节剂的作用，而ceRNA可通过螯合miRNA起作用，充当miRNA分子海绵[23]。lncRNA通过不同的分子机制起作用，涉及与DNA、RNA和蛋白质的各种相互作用。

3.2 lncRNA调控肝细胞癌的发生发展及作用机制 lncRNA和miRNA一样都经常在HCC中失调。lncRNA可通过多种机制参与HCC的发生、发展，在表观遗传、转录和转录后水平上调节下游靶标的表达和稳定性[24]。首先，在表观遗传学水平上，lncRNA可以通过募集染色质修饰因子来改变染色质结构，调节靶基因的表达[25]。已经证明了在HCC中上调的lncRNA CDKN2B可促进细胞增殖，其表达水平与HCC呈正相关[26]。其次，lncRNA能够调节非蛋白质编码基因(如microRNA)的表达。在这方面，lncRNA FAL1被报道与miR-1236竞争性结合，促进HCC细胞增殖和转移，在HCC中起癌基因的作用[27]。此外，有研究发现lncRNA HOXD-AS1在HCC组织中也显著上调，其可与SOX4共享miRNA反应元件，过表达HOXD-AS1可与miR-130a-3p竞争性结合，阻止SOX4介导的miRNA降解，从而激活EZH2和MMP2的表达，促进HCC的转移[28]。另外，还有研究发现lncRNA除了在上述过程中具有调控作用，在转录后水平亦具有调控作用，其可通过调节剪接因子和mRNA稳定性来控制HCC的进程[22]。例如，HCC中一种称为转移相关性肺腺癌转录本1(MALAT1)的lncRNA上调，可起原癌基因的作用，可通过激活Wnt途径增加剪接因子SRSF1(富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子1)的表达，从而导致S6激酶1(S6 K1)的凋亡和选择性剪接，进一步激活mTOR途径而导致HCC进展[29]。高通量测序技术发展以来，除了上述lncRNAs，Huo XQ等[30]还发现了大量失调的lncRNAs，其中一些也可在转录后水平调节HCC的病理、进展、结局和维持癌干细胞样特性等关键方面起重要作用。特别是，近年来随着ceRNA的研究发展，lncRNA还可充当竞争性内源性RNA在HCC中起重要作用[23]。已发现的在HCC中过表达的一种lncRNA——结肠癌相关转录因子1(CCAT1)可与let-7(一种miRNA)竞争结合，导致HCC细胞的增殖和迁移增加[31]。类似地，lncRNA Unigene56159在与HBV相关的HCC组织中显著上调，并且也通过充当miR-140-5p的ceRNA来增加Slug表达，并且lncRNA Unigene56159还被证实是上皮间质转化(EMT)和HCC细胞迁移所必需的[32]。

除了上调的lncRNA，一些显著下调的lncRNA在HCC中也起着关键作用。例如，在HCC组织和HCC细胞系(Huh7、HepG2和SMMC-7721)中，lncRNA BRAF激活的非编码RNA(BANCR)的表达显著降低，过表达lncRNA BANCR会抑制HCC在体外和体内的增殖[33]。此外还有很多下调的lncRNA，如lnc-FTX，其可通过与微型染色体维持蛋白2(MCM2)相互作用，从而抑制HCC细胞的增殖，起到抑癌作用，并与预后密切相关[34]。

4 circRNA

4.1 circRNA的概念及功能 环状RNA(circular RNA，circRNA)是近年来新发现的一类内源性长的非编码RNA，其形成一个共价闭合的连续环，无5′→3′极性，不含polyA尾，具有相对不稳定的结构，在真核转录组中具有高度的组织特异性表达。近年来，发现在哺乳动物细胞中存在成千上万的circRNAs，它们通过与microRNAs或其它分子结合，在转录或转录后水平上调控基因表达，进而抑制其功能[35]。

4.2 circRNA调控肝细胞癌的发生发展及作用机制 最近的研究表明，一些circRNAs在HCC中失调，参与了HCC进程中涉及的多种生物学过程。根据circRNA在HCC中的表达情况，亦可分为上调表达和下调表达的circRNAs。上调表达的circRNAs，如circ_0005075、circ_0016788、ciRS-7、circ_0128298、circ_0091579和circ-CDYL等被证实为HCC诊断或预后的生物标志物[36-41]。如以miR-200a为靶点的circRNA-101368在HCC中上调表达，与HCC患者预后较差显著相关，其基因敲除可抑制HMGB1、RAGE和NF-κB的迁移和蛋白水平[42]。circRNA-100338在HCC中高表达，其通过致促mTOR信号通路更为活跃从而影响乙型肝炎相关的肝癌患者的预后[43]。cSMARCA5被报道通过刺激miR-17-3p和miR-181b-5p促进肿瘤抑制因子TIMP3表达，从而抑制HCC细胞的生长和迁移[44-47]。其它circRNA，如circSMAD2、circSETD3、circFBLIM1、circMTO1和circHIPK3，也可通过调节HCC的增殖、迁移、癌细胞凋亡和上皮-间质转化在HCC中发挥致癌或抑癌作用[48-51]。除了上调表达的circRNAs，下调表达的circRNAs，如circ_0004018、circ_0003570和circZKSCAN1等也具有较好的诊断价值。circ_0004018和circ_0003570低表达与血清AFP水平升高、肿瘤体积大、肿瘤分化差有关；circZKSCAN1低表达与肿瘤数目、肝硬化、血管浸润、MVI和肿瘤等级相关[52-53]。另外hsa-circ-u0001649在HCC中显著下调也抑制HCC的发生、发展[54]。还有，在邻近HCC的正常组织中，也存在明显下调的circRNA，如circRNA Circ3p1，其对HCC中的miR-4641应答而促进PCK1的表达，进而抑制HCC在体内外的增殖、侵袭和转移等[55]。可见，越来越多的circRNA都被发现具有功能。除此之外，Huang XY等[56]利用circRNA微阵列，于HCC中也鉴定出了大量(226个)差异表达的circRNA，其中189个显著上调，37个显著下调，并且他们还证实miR-141-3p是circRNA-10038的直接靶点。由此可见，HCC中亦存在大量circRNA差异表达，circRNA也可作为一个潜在的、有价值的HCC诊断生物标记物和治疗靶点。

5 siRNA

5.1 siRNA的概念及作用机制 siRNA，是一种长20～25 nt的短双链RNA，常被称为小干扰RNA。它能特异性地识别结合mRNA，从而抑制基因的表达。目前siRNA的分子作用机制以及过程还不完全清楚，不过大致分为几个阶段[57]：siRNA形成阶段、沉默复合物(RISC)形成阶段、效应阶段以及倍增阶段。即在内源性途径中，经过一系列步骤合成的siRNAs可诱导形成沉默复合物(RISC)，沉默复合物通过捕获互补mRNA，对mRNA进行切割，从而导致了靶基因的降解，对基因表达起负调控作用。

5.2 HCC与siRNA的相关性 siRNAs对包括HCC在内的许多人类肿瘤具有巨大的治疗潜力[58]。早在2005年，Morrissey DV等[59]向小鼠注入Fas siRNA(针对Fas基因的siRNA)以保护小鼠免于发生自身免疫性肝炎时，首次证明了siRNA治疗的潜力。此后大量研究证明[59-60]siRNA是通过RNA干扰(RNAi)实现靶向癌基因沉默的有力工具。它的靶向基因控制能力给癌症治疗带来了新希望。赵丹等[60]利用siRNA干扰技术抑制了HepG2肝癌细胞系的MTH1基因表达，发现干扰MTH1的表达后，降低了HCC癌细胞的迁移能力，促进了HCC癌细胞的凋亡。此外，许多其它研究也证明siRNA干扰在HCC治疗中具有明显作用[61-63]。

然而，临床应用中研究者发现一个不容忽视的问题，就是siRNA表现出很差的药理学特性，如低血清稳定性、非靶向性和固有免疫反应等，这对临床应用提出了重大挑战，因此，siRNA在治疗上也面临着许多障碍[64]。有效的siRNA进入靶细胞细胞质是siRNA成功治疗应用所必需的。最早使用病毒(如腺病毒、逆转录病毒和慢病毒)作为siRNA传递的潜在载体，因为它们能够特异地将自己的基因组材料附着和运输到细胞中[63]。但随后发现它们的临床应用受到潜在的突变、炎症和免疫反应的限制。后面基于阳离子聚合物、肽和脂质的各种合成载体增强了siRNA络合物的结构稳定性[65]。然而，这又增加非特异性细胞毒性的程度。2014年，Hong CA等[66]开发了几种siRNA纳米载体，用于增强细胞摄取和靶向基因沉默的治疗性和非病毒性。其他研究者基于新型多功能核/壳纳米粒子、脂质纳米颗粒、聚合物或无机材料的siRNA用于HCC的治疗，有效地提高了基因的有效载量和转染效率[67]。

此外，随着多靶点RNA干扰(RNAi)策略用于治疗多基因疾病(尤其是癌症)研究的深入。多靶点siRNAs的研究在HCC中的应用也逐步展开。Li TJ等[68]设计了多靶点siRNAs用来抑制HCC细胞中肿瘤细胞增殖相关基因(Net-1)、肿瘤细胞运动和转移基因(EMS 1)和肿瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)基因的表达。最后发现，与单靶siRNA相比，多靶siRNAs具有更好的沉默作用，可明显抑制HCC发生和发展等。

6 小结与展望

综上所述，piRNA/PIWI蛋白、miRNA、lncRNA和circRNA在HCC组织都有异常表达，它们通过各种途径调控HCC的发生与发展。异常表达的piRNA、miRNA、lncRNA和circRNA的发现为研究HCC进展的分子机制开辟了一个新的领域。许多可作为HCC诊断和治疗的生物学标志物，为临床HCC早期诊断和防治提供思路。不过，像HCC中的piRNA研究尚还处在初步阶段，circRNA也为近些年新发现的ncRNA，许多作用机制还不清楚。miRNAs在HCC中的研究虽较多，但其调控作用、表达模式和临床应用仍有许多不明地方，亦有待进一步挖掘和探索。而siRNA作为潜在的新型抗HCC的药物也显示了大好前景，并有望成为HCC致癌位点的良好靶向治疗药物。但是因siRNA传递中的各种问题，其临床应用仍有待进一步改进。因此，持续探索各种ncRNA在HCC中的作用和机制，可为防治HCC提供更好的策略和思路。