circRNA与卵巢癌的关系研究进展

丁彩云， 倪观太

(皖南医学院第一附属医院，弋矶山医院妇产科，安徽 芜湖 241001)

卵巢癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤之一，是妇科恶性疾病病死率最高的疾病，且发病率高，每年有超过200 000例的新诊断病例[1]。卵巢癌有多种类型，以上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)最为常见[2]。由于卵巢体积小，无包膜，且处于盆腔深部，EOC在早期常没有明显的症状，大多数患者在最初诊断时已处于晚期。因此，对卵巢癌发生发展的分子机制进行深入研究，寻找早期诊断标志物和治疗靶点迫在眉睫。目前，有研究显示[3-4]，环状RNA (circular RNA，circRNA)充当miRNA分子“海绵”，间接参与多种恶性肿瘤的发生、发展过程。此外， circRNA与卵巢癌相关性的研究显示[1]，circRNA在卵巢癌组织中与癌旁组织表达量存在差异，故circRNA有望成为新的肿瘤分子标志物，在卵巢癌的早期诊断与预后评估中发挥重要作用。

1 circRNA概述

1.1 circRNA的概念、鉴定方法、形成机制及显著特征 circRNA是一种广泛分布于真核生物的新型内源性RNA[5]，有共价闭合环状结构的非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，长度在几百到几千 bp 不等，没有传统线性 RNA 的5＇帽结构及3＇多聚腺苷酸尾，具有抗RNA降解的能力，更具有稳定性。ncRNA通常不参与蛋白质合成，在人类基因组中占比超过95%[6]。尽管不携带任何编码序列，但ncRNA在多个疾病学科中得到了广泛研究，包括如微小RNA(microRNA， miRNA)、小核RNA(small nuclear RNA， snRNA)，长链非编码RNA(long non- coding RNA，lncRNA) 、circRNA。circRNA是ncRNA家族的最新成员，最早发现于1979年[7]。直到近二十年来，随着高通量测序、PCR、RNA提取等分子技术的迅速发展[8]，已识别circRNA数量的增多及对其功能研究的深入，学者们得以对其进行广泛的鉴定和研究。研究者采用几种识别反式剪接位点的计算算法，包括能够重建全长circRNA的算法[9]，掌握了circRNA的形成主要有前体mRNA 直接的反式剪接(direct backsplicing)和外显子跳读(exon skipping)两个机制。对反式剪接片段的识别，是鉴定circRNA的一个重要标志。

根据来源不同，可将circRNAs分为三类：外显子circRNAs(exonic circular RNAs，ecircRNAs)[10]、内含子circRNAs(circular intronic RNAs，ciRNAs)[11]、外显子-内含子共同形成的circRNAs(exonic-intronic circRNAs，EIciRNAvs)[12]。circRNAs具有高度保守性，Memczak S等[3]检测到1903种小鼠circRNAs，其中81种与人类circRNA相同。circRNA具有组织表达特异性，大多数 circRNA 位于细胞质中，可能与circRNA的编码小肽功能及调节RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)的形成存在关联；少数内含子circRNA主要分布于细胞核，可参与转录后调控等过程。不同的circRNA在不同发育阶段、不同组织中表达量不同，如circHIPK3的表达量在胶质瘤细胞中表达量明显高于正常神经细胞[3]。

1.2 circRNA在组织细胞中的作用 circRNA在不同分子生物学途径中发挥重要作用，主要有miRNA海绵、结合蛋白质、转录调节以及编码小肽[13]。现研究证明[4]，circRNA主要充当miRNA海绵，通过其上的miRNA结合位点吸附特定的miRNA，竞争性抑制miRNA的活性，进而调控靶基因表达[14]。例如Zheng QP等[15]发现，circHIPK3共有18个结合位点，可与9 种不同的 miRNA结合，使得miRNA-124 在恶性肿瘤中与细胞生长相关的作用会受到circHIPK3的明显抑制。除“海绵作用”外，circRNA还可通过影响亲本基因表达，提高转录效率，翻译特定蛋白质等方式参与生物学过程的调控。Burd CE等[16]发现circRNA形成与pre-RNA的经典剪接相互竞争，circRNA形成与线性 RNA呈负性相关，这表明circRNA可以通过与线性剪接相互竞争来调控相关线性RNA的形成而调节基因表达[17]。CircRNA可在转录的起始和延伸发挥调控作用，增强转录。在起始阶段，Li ZY等[12]发现，circRNA可促进起始前复合物的形成。在延伸阶段，Zhang Y等[11]发现circRNAs在其转录位点积累，并通过与RNA聚合酶Ⅱ相互作用增加亲本基因转录延长。有证据表明，circRNAs参与调控几乎所有的细胞功能，与多种疾病，特别是肿瘤的发生、发展、转移等机制关联密切[12]。circRNAs在重要的遗传途径中(尤其是肿瘤学)具有巨大的活性，可预见其两种不同的治疗潜力：起miRNA海绵作用的circRNAs的过表达可提高miRNA靶基因的表达，从而沉默肿瘤组织中致癌和高表达的circRNAs，或上调在肿瘤中低表达、有抑制功能的circRNAs[5]。

2 circRNA与卵巢癌

卵巢癌为女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，全世界每年有22万名妇女患有上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)，早期诊断困难，后期发展迅速， EOC是女性第四大常见死因[18]。信号通路和细胞机制的失调在癌症的发生、发展和侵袭中起着至关重要的作用[19]。

关于circRNAs对卵巢癌的调控作用，它们之间的相关性是研究人员非常关注的问题。Ahmed I等[20]首次对临床卵巢癌中circRNAs的表达进行了分析，他们报道了大量circRNAs在肿瘤样本中的差异表达；还检测了原发性和转移性卵巢肿瘤之间mRNA和circRNA的表达差异；他们恰当地区分了原发肿瘤和转移病灶中circRNA的RNA外切酶抗性和稳定性，而不是mRNA。有趣的是，卵巢癌转移癌中circRNA的信号通路，如STAT、AKT、NF-kB、TGF-B、ILK、HGF和VEGF均下调，这些通路通常被激活以产生线性RNA和血管生成[4]。

结构稳定、组织特异性强的circRNA 在卵巢癌的早期诊断、发生、发展、放化疗敏感性及预后方面有重要的研究价值。circRNA 主要发挥miRNA “海绵”作用，调控肿瘤的发生、发展，通过激活异常增殖信号通路，调节肿瘤细胞增殖周期，参与血管生成和上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，抑制肿瘤细胞凋亡途径发挥作用[21]。特定 circRNA 的上调或下调与肿瘤放化疗敏感性相关，某些 circRNA 的表达可以预测肿瘤的复发[22]。

恶性肿瘤细胞常具有无限增殖以及侵袭、迁移的能力。卵巢癌在发生、发展过程受到十分复杂的异常调控。近年来circRNA在卵巢癌中的关注度越来越高，有望成为新的分子标记物，如 hsa_circ_0061140 通过发挥 miR-370 分子海绵的作用，上调 FOXM1 的表达，促进卵巢癌细胞的增殖、转移；circ-ITCH 在卵巢癌中发生表达下调，作为 miR-145 的分子海绵，削弱其对 Ras p21 蛋白活化子 1(RASA1)表达抑制，从而抑制卵巢癌细胞增殖及转移[23-24]。现对 circRNA在卵巢癌中的侵袭转移能力、增殖能力以及预后指标这三个方面进行以下总结。

2.1 circRNA 参与调控卵巢癌的增殖和凋亡 不受机体控制、抑制凋亡、无限生长是肿瘤发生的特点。癌细胞的无限增殖会消耗大量的营养物质，最终引起患者的恶病质，是晚期卵巢癌患者死亡的一大因素。恶性肿瘤细胞从原发部位转移到远端部位的侵袭与转移是一个综合性生物学过程，常受到多种基因、多种蛋白的调节[25]。circRNA 已被证实参与了多种恶性肿瘤的发生与发展，其作用是作为miRNAs海绵或通过与RNA相关蛋白结合并形成RNA蛋白复合物来调节基因转录，进而影响肿瘤的增殖和凋亡[13，26]。

Luo L等[27]在2018年研究发现，相较于正常卵巢上皮细胞，circ-ITCH在4种人上皮性卵巢癌细胞系中均表达下降，分别为SKOV3、A-2780、OVCAR-3和HO-8910，且在SKOV3细胞中下调最为明显。CircRNA-ITCH可通过靶向下调miR-10a表达，进而抑制SKOV3细胞的增殖并促进其凋亡，与肿瘤体积小、FIGO期缩短、OS延长均有关。Gan XL等[28]研究发现，circMUC16在EOC组织中的表达量明显高于正常卵巢组织，且其表达与EOC的分期、分级进展有关。circMUC16通过吸附miR-199a-5p调控Beclin1和RUNX1，促进上皮性卵巢癌的增殖、侵袭与转移。

另外，Li QH等[29]发现，circ-CSPP1在卵巢癌组织中表达显著上调，且 miR-1236-3p为circ-CSPP1的靶点，二者表达呈显著负相关。相关报道显示[29]，体外沉默circ-CSPP1的卵巢癌细胞在RNA和蛋白质水平上都显著降低了锌指E盒结合同源异形盒1(zinc-finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)的表达，并且EMT相关标记(E-cadherin和N-cadherin)随着ZEB1的表达而变化。Circ-CSPP1的沉默也导致基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和血管内皮生长因子A(VEGFA)表达降低，两者均与肿瘤发生有关。Li QH等[29]的实验表明circ-CSPP1通过充当miR-1236-3p海绵，损害miR-1236-3p对ZEB1的抑制作用，从而促进EMT和卵巢癌的发育。

Zhang MY等[30]也通过qRT- PCR 等相关实验操作技术，对正常的卵巢组织和卵巢癌组织中 circRNA进行检测，结果显示hsa-circ-0051240在卵巢癌组织中表达明显上调，并可通过miR637/KLK4轴对卵巢癌细胞进行调控，导致卵巢癌细胞的增殖和迁移、侵袭能力发生明显增强。Bao LP等[31]研究发现，VPS13C-has-circ-001567在卵巢癌组织中高表达，在卵巢癌SKOV3和OV-1063中，敲除该基因后，使得G1期细胞周期停滞，S1期细胞百分率下降促进细胞的凋亡，抑制其增殖，降低了SKOV3和OV-1063细胞的侵袭能力。

2.2 circRNA与卵巢癌的诊断和预后 近年来，circRNAs被认为是某些类型肿瘤的生物标志物[32-33]。例如，circRNA通过IL6-STAT3途径调节胰腺癌增殖[34]；上调的circRNA UBAP2充当miRNA-143的海绵，促进骨肉瘤的进展[35]；circRNA-MYLK是一种促进膀胱癌发生发展的内源性RNA，且circRNA-MYLK水平与膀胱癌患者的分期和分级有关[36]。

circRNA在卵巢癌细胞株以及卵巢癌患者的组织样本和血浆中的表达，以及相应的病理类型，提示circRNA或可成为卵巢癌的一种新的诊断与预后标志。Ning L等[37]对比54例卵巢癌组织和与之配对的正常卵巢组织，进行了circRNA序列测定和qRT-PCR等操作验证，发现circBNC2、circEXOC6B、circFAM13B、circN4BP2L2和 circRHOBTB3 在卵巢癌组织中的表达明显下调，而 circCELSR1 的表达显著上调。此外，Ning L等[37]应用非参数检验、秩和检验等统计学方法，确定差异表达的circRNAs与EOC的各种临床病理特征之间的关系。其分析结果表明，低水平的 circBNC2 与发病年龄较低、FIGO 分期高、淋巴结转移和大量腹水有关；低水平的circEXOC6B 和 circRHOBTB3 与发病年龄较低及淋巴结转移有关；低水平的 circFAM13B 和circN4BP2L2 与发病年龄较低、FIGO 分期高及淋巴结转移有关；高水平的 circCELSR1 与 FIGO 分期高、大量腹水及残留肿瘤直径较大相关；高水平的circN4BP2L2 与相对较长的无进展生存期(PFS)相关；高水平的 circEXOC6B 与相对较长的总生存期(OS)相关。以上结果显示circEXOC6B与circN4BP2L2有预测卵巢癌患者预后的意义，或可作为卵巢癌患者新的预后标志物。

circHIPK3包含miRNA-558的两个关键结合位点，并且可以吸附海绵miR-558来抑制heparanase(HPSE)的表达[38]。Liu N等[2]检测了69对上皮性卵巢癌组织样本和匹配的邻近非癌组织样本，qRT-PCR分析结果显示EOC组织中circHIPK3的表达明显高于邻近的非癌组织。在4种卵巢癌细胞系(A2780、HO-8910、SKOV3和CAOV3细胞)中，circHIPK3的表达也显著升高，提示circHIPK3的过表达，可能与肿瘤的进展有关。Lin N等[2]进一步研究发现，EOC患者中高表达的circHIPK3与淋巴结浸润和晚期FIGO分期呈正相关，而与年龄、肿瘤大小、肿瘤位置等无相关性。他们采用Kaplan-Meier法和log-rank检验分析circHIPK3表达与ECO预后的关系，提示相较于circHIPK3表达量较低的ECO患者，circHIPK3表达量较高的病人PFS和OS明显下降；多因素Cox分析显示，高外周血circHIPK3是EOC患者独立的不良预后因素。因此，其表明circHIPK3作为EOC的预测因子，具有重要的临床价值。

经circRNA表达谱和生物信息学分析，证实circLARP4在胃癌中高表达，通过与miRNA-424结合抑制胃癌细胞的增殖、侵袭，并与胃癌患者的病理分期和不良预后有关[5]。然而，circLARP4在卵巢癌中的潜在临床作用尚不清楚[39]。Zou T等[40]采用qRT-PCR检测78例卵巢癌组织及癌旁正常组织，发现circLARP4在卵巢癌组织中的表达明显低于相应的对照组。追踪患者病情发展，应用卡方检验评估circLARP4的表达与临床病理参数之间的关系，采用Kaplan-Meier法评估生存曲线，建立多因素Cox分析模型来做肿瘤预后分析，结果显示，circLARP4的表达与FIGO分期和淋巴结转移显著正相关；circLARP4为卵巢癌预后的独立危险因素；circLARP4的低表达与卵巢癌患者预后不良相关。因此，circLARP4表达下调，或可成为卵巢癌预后的潜在生物标志物。

以上研究表明 circRNA 与卵巢癌之间关系密切，与卵巢癌患者的PFS和OS等预后指标存在密切关联，或可作为卵巢癌新的诊断与预后指标。

3 小结与展望

circRNA是一种新类型的非编码RNA，在细胞中含量丰富，因其特殊的环状结构，具有稳定性、序列高度保守性、组织和时空特异性等特征。circRNA是一类新的生物分子，目前该研究领域主要有三个方向：①细胞中circRNA的表达与分布情况；②传统线性RNA与circRNA的结构与产生方式；③circRNA的功能。circRNA 的各种功能正逐渐被揭示，其中，circRNA作为miRNA 分子海绵的作用，与一系列疾病的发生、发展密切相关。

circRNA在恶性肿瘤中的作用也已成为当前的研究热点，有望成为恶性肿瘤的新型诊断标记物、分子治疗靶点和预后评估指标。虽然目前关于circRNA与卵巢癌的研究取得了一定的成果，但报道文献数量较少，仍有许多问题亟待进一步探索与挖掘，如 circRNA 与 卵巢癌EMT的发生，circRNA 与其下游作用靶点之间的关系，参与卵巢癌细胞侵袭、转移、增殖的调节机制，与卵巢癌的细胞病理分型、预后调节以及基因诊断的关系等。这些问题为今后研究 circRNA与卵巢癌的关系提供新思路。