微小分子RNA与慢性髓性白血病关系的研究进展

王淑娴，王方方综述，郁多男审校

0 引 言

微小分子RNA(microRNA，miRNA)是一群由内源性基因编码的，长度大约为19～24个核苷酸的非编码单链小分子RNA[1]。miRNA在转录后水平调控多种基因表达，几乎参与所有的生物过程，包括细胞生长、发育、增殖、分化等[2]。miRNA的表达失调会引起不同的疾病，如心血管系统疾病、神经系统疾病、肿瘤等[3-5]。慢性髓性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一种由多种病因引起的骨髓造血干细胞克隆性增殖性肿瘤[6]。近年来， miRNAs与CML关系的研究相继展开。本文主要就miRNAs与CML关系的研究进展作一综述。

1 miRNA

原始miRNA(pri-miRNA)在核内经DGCR8和Drosha催化形成前体RNA(pre-miRNA)。pre-miRNA在胞质内由RNA酶Dicer加工处理后形成成熟的miRNA后与Argonaute2(Ago2)相互作用形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)。miRNA通过RISC降解靶基因的mRNA和(或)抑制翻译介导基因沉默[7]。miRNA的异常表达会引起多种疾病的发生[3-5]。在许多人类肿瘤中miRNA异常表达，如食管鳞状细胞癌患者miR-655低表达与差预后密切相关[8]；急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者miR-193-3p低表达，体外研究发现miR-193-3p通过靶向KIT-RAS-RAF-MEK-ERK(MAPK)信号级联及下游的细胞周期调节因子CCND1，诱导AML细胞凋亡、抑制AML细胞增殖[9]。因此， miRNA有可能作为疾病诊断、判断疗效及预后的标志物，且有可能成为潜在的治疗靶点[10]。

2 CML

CML是一种常见的血液恶性肿瘤，其特征是伴有费城染色体(philadelphia chromosome，Ph)的髓系造血祖细胞的异常扩增。临床分期为：慢性期(chronic phase，CP)、加速期(accelerated phase，AP)、急变期(blast phase，BP)[11]。酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)是治疗CML的一线药物[12]。针对CML不同的临床分期，TKIs均有一定疗效，但是也存在以下问题：①由于患者BCR-ABL1激酶结构域常发生点突变，产生突变基因，如F317L、V299L、E255K/V、F359V/C、G250E、Y253H以及T315I等，其中T315I同时对一、二代TKIs耐药。这些突变基因的存在使一、二代TKIs无法发挥相应作用，导致CML的进展或复发[13-15]。第三代TKI帕纳替尼对所有常见的BCR-ABL1单基因突变有效，包括具有高度抗性的T315I。但BCR-ABL1等位基因中复合突变的出现可能会对帕纳替尼出现抗性，尤其是包含T315I的复合突变对目前所有的TKIs显出更高水平的抗性[16]；②CML患者需要长期TKIs治疗，而TKIs几乎均存在不良反应，如骨髓抑制[17]、QT间期延长、胸腔积液、代谢紊乱、肝衰竭等[12,18]。这些不良反应在停药或减少剂量后可逆转，但部分患者可能因不耐受TKIs的不良反应而完全停止治疗，导致疾病进展。因此，迫切需要找到新的生物靶向分子以进一步解决TKIs耐药和改善TKIs不良反应。

3 与CML有关的miRNAs

3.1miRNA在CML发病机制中的作用

3.1.1miR-139-5pmiR-139-5p定位于染色体11q13.4[19]，被认为是肿瘤抑制因子。在乳腺癌、结直肠癌和食管鳞状细胞癌中，miR-139-5p能抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移[20]。为探究miR-139-5p在血液系统恶性肿瘤发病机制中的作用，Choi等[21]检测了CML患者和健康对照者的骨髓和外周血中miR-139-5p的表达情况。结果发现CML-CP患者miR-139-5p的表达明显下降。进一步研究发现，miR-139-5p不仅是早期造血过程中调控细胞增殖的关键因子，且能直接靶向抑制基因Brg1表达，由于Brg1是可促进cyclin D1表达及抑制p27表达的促癌基因，所以miR-139-5P能抑制CML细胞增殖，促进CML细胞凋亡。这些研究结果提示miR-139-5p具有有效的抗白血病作用，可能成为CML治疗研究的新方向。

3.1.2miR-320amiR-320a定位于8p21.3，在多种肿瘤中异常表达，如肝细胞癌、胃癌和前列腺癌[22]。在CML中，miR-320a起到抑制肿瘤的作用。Xishan等[23]通过荧光定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-PCR, qRT-PCR)检测发现CML细胞系KCL-22、K562、KU812和MEG01及CML患者体内的miR-320a表达均降低。Li等[24]发现，BCR-ABL1基因可通过诱导PI3K-AKT-NF-κB信号通路的磷酸化导致CML的发生和进展。Xishan等[23]在K562细胞中过表达miR-320a后，BCR-ABL1表达量和PI3K、AKT和NF-κB磷酸化水平降低，K562的集落形成能力下降，体内实验也验证了这一结果。将过表达miR-320a的K562细胞(RV-miR-320a)皮下注射到裸鼠体内，35 d后取瘤对比，发现RV-miR-320a组肿瘤体积及瘤体Ki67+细胞数明显低于对照组，凋亡细胞增加。体内外实验结果表明，miR-320a通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路降低肿瘤细胞增殖、增加肿瘤细胞凋亡而发挥抑癌作用。为进一步分析miR-320a与临床预后的关系，Xishan等[23]采用Kaplan-Meier法对miR-320a高表达和低表达组的生存差异进行比较分析。结果发现miR-320a低表达的CML患者总生存期和无复发生存期明显短于miR-320a高表达的CML患者。以上研究结果均提示miR-320a是CML中重要的抑癌基因。

3.1.3miR-362-5pmiR-362-5p可抑制神经母细胞瘤细胞的增殖和迁移；下调肿瘤抑制因子CYLD，在胃癌和肝细胞癌中发挥致癌作用[25]。Yang等[26]采用qRT-PCR检测白血病细胞系中miR-362-5p的表达水平，发现四种白血病细胞系BV173、K562、Ball-1和Jurkat中miR-362-5p高表达，以CML细胞系(BV173和K562)的表达水平最高。进一步采集40例新鲜CML患者外周血研究miR-362-5p在CML患者体内的表达情况，检测结果显示 miR-362-5p表达水平明显高于26例健康对照者。更重要的是，经TKIs治疗获得完全血液学反应后，8例CML患者的miR-362-5p明显下降。这些研究结果提示miR-362-5p可能参与CML的发病。该研究还发现，在异种移植模型中，降低miR-362-5p水平后，GADD45α表达上调，肿瘤生长被抑制。由于miR-362-5p的靶基因GADD45α被认为是肿瘤抑制因子[27]，而miR-362-5p促癌的机制可能是CML中高表达的miR-362-5p负向调节GADD45α，促进CML发生发展[26]。所以，Yang等[26]提出用miR-362-5p抑制剂下调miR-362-5p水平，以抑制癌细胞的增殖、增强癌细胞凋亡。因此，靶向miR-362-5p有可能成为治疗CML的新策略。

3.2miRNA在TKIs耐药的CML中的作用

3.2.1miR-126miR-126在乳腺癌、胃癌和胰腺肿瘤的生物学过程中发挥重要作用[28]。miR-126在CML中的作用及其应用也是近年的研究热点。Zhang等[29]研究发现，CML白血病干细胞(leukemia stem cells，LSCs)中miR-126的表达水平低于正常的长期造血干细胞，其机制可能为BCR-ABL将SPRED1磷酸化，导致抑制了介导miRNA成熟的RAN/EXP-5/RCC1复合体，导致LSCs中成熟miR-126减少。进一步通过小鼠模型发现，骨髓中的内皮细胞向LSCs提供miR-126。功能学实验发现，miR-126可增强LSCs静止能力，以摆脱TKI药物的攻击，且miR-126还可增强白血病细胞增殖的能力。根据以上研究结果，Zhang等[29]研发了miR-126抑制性药物CpG-miR-126 inhibitor以增强TKI对于LSCs的攻击作用，进而降低白血病细胞的产生。

3.2.2miR-199a/b-5pmiR-199a-5p和miR-199b-5p是同一个miRNA家族的两个不同的成员，具有相同的种子序列，在头颈癌、肝细胞癌和肺癌中被鉴定为肿瘤抑制性miRNAs[30]。Chen等[30]通过使用细胞学方法与酸性水泡细胞器染色来测量自噬比率，发现对伊马替尼耐药的K562R和KU812R细胞系相对于亲代细胞有更高水平的保护性自噬，使伊马替尼疗效降低。为进一步确认K562R细胞中的自噬形成，用免疫印迹测定法检测了自噬标记，结果发现与K562细胞相比，K562R细胞中的LC3-II，ATG5和p62水平有所提高，而抑制自噬后，K562R细胞对伊马替尼的敏感性增高。该实验通过qRT-PCR发现，miR-199a-5p和miR-199b-5p在K562R和KU812细胞中的表达水平均较低，而过表达miR-199a/b-5p，自噬减少同时凋亡增加，增强了K562R细胞中伊马替尼的疗效，其机制可能是过表达的miR-199a/b-5p直接靶向WNT2，抑制其下游信号通路来降低自噬和增强伊马替尼敏感性。因此，miR-199a/b-5p有可能为改善伊马替尼耐药提供新方法。

3.2.3miR-451miR-451家族包括人类基因组中的两个主要成员：hsa-miR-451a和hsa-miR-451b，定位于17号染色体上，与多种肿瘤发生密切相关，如肺癌、乳腺癌和结肠癌等[31]。Alves等[32]研究发现与对伊马替尼敏感的K562细胞系相比，对伊马替尼耐药的模型K562-RC和K562-RD细胞系中miR-451的表达显著降低，其中K562-RD细胞的miR-451的表达水平比对伊马替尼敏感的细胞系K562低3.8倍(P=0.0048)。CML-BP和CML-AP患者的miR-451表达较CML-CP患者下降更明显。此外，对伊马替尼治疗敏感的CML患者miR-451表达增高，而治疗效果较差的患者miR-451的表达水平较低。以上结果提示miR-451的表达水平影响着CML对TKIs的治疗反应，以及对CML的不同时期进展起到一定的作用。

4 结 语

目前治疗CML的首选药物是TKIs，虽然TKIs优于干细胞移植等其他治疗方法，但仍存在很多不足，其中最主要、最棘手的是耐药问题。miRNAs在转录后水平的基因表达调控中发挥着重要作用，其参与CML的发生发展，在TKIs治疗过程中参与调控耐药过程，有的miRNAs增强TKIs的抗性，有的miRNAs增强CML细胞对TKIs的敏感性。在CML中，miRNAs不仅具有作为药物靶点和生物标志物的巨大潜力，且具有诊断和(或)治疗的价值，希望将来miRNAs能成为解决TKIs耐药问题的新方法。