长链非编码RNA在腰椎间盘退变中的研究进展

宋健，詹玉林2,，周小莉，林志康

(1.上海中医药大学，上海 201210； 2.上海健康医学院附属第六人民医院东院骨科，上海 201210)

腰痛是困扰人类生命健康的最主要的慢性疾病之一。最新发布的《全球疾病、伤害和风险因素负担研究2017》显示，以颈、腰痛为主的肌肉骨骼疾病成为“残疾生活年数”发生率最高的病种，这主要与适龄工作人员趋于办公久坐环境以及此类疾病少受医疗政策关注有关[1]。慢性腰痛消耗了大量的医疗资源，不仅给患者和社会带来了严重的经济负担，还留下了诸多疼痛后遗症(如抑郁、焦虑和睡眠障碍)[2]。一项基于中国南方人群的流行病学研究显示，55岁以下的成人90%会出现腰椎间盘退变(lumbar disc degeneration，LDD)，且患病率随着年龄的增长而升高，10%的患者因此造成慢性残疾，LDD与腰痛呈显著正相关[3]。LDD是由多因素导致的复杂病种，主要由体外因素(如不协调应力负荷、熬夜工作、伏案久坐、吸烟、肥胖)的长期持续影响与内部机体易感遗传因子异常表达共同导致。LDD的机制研究主要涉及遗传信息的差异表达、调控信号通路的细胞因子所介导的促炎与抗炎过程失衡以及细胞外基质合成代谢与分解代谢的紊乱等。遗传信息表达异常又包括增殖、凋亡、衰老、自噬等细胞活动。现就长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)在LDD中的研究进展予以综述。

1 LDD与腰痛

椎间盘由三个结构成分组成：位于中心的软胶质髓核，主要由髓核细胞组成，分布有丰富的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖，保留盘内水分，维持椎间盘的弹性；周围环绕片层状的纤维环，主要由成纤维细胞组成，内含同心铺层、交错穿梭的张力性Ⅰ型胶原和弹性纤维，维持椎间盘的韧性；上下分别连接两个双层软骨终板，保持椎间盘的高度和稳定，并负责吸收从盘外扩散的营养与氧气[4]。椎间盘的各组成部分相互协作，保证了脊柱的正常弯曲和扭转，并起到缓冲减震的作用。椎间盘是人体最大的无血管组织，正常情况下，具有特定的解剖屏障结构，无淋巴引流，虽然具有免疫原性的Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖等细胞外基质成分可以与外界免疫细胞直接接触，免疫细胞也可以通过软骨终板进入盘内，但并不会发生损害性免疫反应，因此被称为“免疫赦免器官”，而免疫赦免状态是椎间盘维持正常生理功能的必要条件[5-6]。

由于内外损伤因素联合作用使免疫赦免状态被打破，椎间盘发生退变。为抵抗损害，盘内髓核细胞、成纤维细胞及免疫细胞活化并分泌促炎症因子，包括肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白细胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-17、γ干扰素、前列腺素E2以及趋化因子等。TNF可通过核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)和促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路调控损伤细胞的凋亡；IL-6负责通过Janus激酶(Janus kinase，JAK)/信号转导及转录激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)和Ras蛋白/磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K) 信号通路，促进B细胞、T细胞增殖分化功能，刺激前列腺素E2的增加以及细胞外基质的分解，显著减少蛋白多糖的合成；γ干扰素通过JAK/STAT途径，增加细胞间黏附分子1表达，使微血管侵入椎间盘；IL-17信号转导产生趋化因子，募集单核细胞和中性粒细胞到达炎症部位；IL-1α、IL-1β促进趋化因子的产生，这些细胞因子可促进B细胞、T细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞的侵入，促进炎症级联反应的发生，继而分泌高水平的β神经生长因子和脑源性神经生长因子，神经痛相关阳离子通道，特别是酸敏感离子通道3和瞬时电位阳离子通道1去极化表达导致致痛性神经纤维侵入，高水平的细胞因子刺激神经信号转导至中枢，引起腰痛的发生[7]。

炎症反应可促使免疫细胞对椎间盘的破坏性损伤，加剧盘内细胞外基质中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-13以及血小板反应蛋白的解聚素与金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif，ADAMTS)-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、ADAMTS-9、ADAMTS-15的分解代谢过程，使椎间盘的弹性结构成分(蛋白聚糖、Ⅱ型胶原)以及水分相对减少，而Ⅰ型胶原增加、高度降低，稳定性遭到破坏，髓核组织不足以承受脊柱强大的压力负荷，应力转向纤维环，致使椎间盘结构破坏[8]。暴露出具有免疫原性的髓核、纤维环组织及细胞外基质成分，引起抗原抗体反应、免疫球蛋白沉积，进而激活弗氏完全佐剂与诱导的胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和MAPK信号通路所致的炎症反应，刺激背根神经节的神经末梢伤害感受器产生疼痛[9]。除传统意义上的椎间盘突出压迫神经根导致的疼痛外，这些观点阐释了LDD导致的非占位腰痛。

2 LncRNA与LDD

LncRNA是转录本序列长度大于200 nt且不具有编码蛋白质功能的RNA， LncRNA物种间保守性较低，曾被认为是微RNA(microRNA，miRNA)偶然结合的副产物，干扰转录调控的进程，被视为转录间的“噪声”“暗物质”[10]。后续的研究证明，LncRNA具有种内保守的二级和三级结构，有些具有与信使RNA(messenger RNA，mRNA)相似的poly(A)尾结构，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控，涉及表观遗传的DNA甲基化和组蛋白修饰、转录过程中转录因子的招募、转录后miRNA的内源竞争及mRNA稳定性的调控，甚至影响翻译水平蛋白的空间构象及功能活性等，在很多细胞生命活动中起着举足轻重的作用，素有“音乐指挥家”之称[11]。LncRNA在不同组织中的表达具有高度特异性，为研究局部特殊病种提供了可靠的依据。

LncRNA作为基因表达的关键调控因子，参与了神经性退变、炎症反应、骨关节炎等疾病的诸多生命过程，包括细胞增殖、分化、凋亡、代谢、迁移侵袭及表型调控等[12-13]。有研究分析了正常与退变髓核细胞中各5个样本中差异表达的LncRNA和mRNA，结果发现，呈现显著差异倍数>10的LncRNA共有116个(67个上调、49个下调)，mRNA有260个，并通过KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)发现了多个有研究意义的生物学通路，包括细胞外基质受体作用、炎症相关的NF-κB/MAPK、Wnt/β联蛋白(β-catenin)、PI3K/Akt信号通路、转化生长因子-β信号通路、ILs细胞因子通路等；另外，还分析出作为抗炎因子的IL-17在退变的髓核细胞中低表达，相关分析显示，IL-17与其邻近基因间长链基因间非编码RNA(long intergenic non-coding RNA，LincRNA)-SLC20A1-1的表达上调显著相关[14]。表明LncRNA在LDD过程中发挥潜在控制炎症表达的效用。

从GEO(Gene Expression Omnibus)基因表达综合数据库中基于GSE56081平台下载的GSE56081基因芯片中共筛选出8个与LDD相关的关键LncRNA (CTC-523E23.5、RP4-639J15.1、RP11-363G2.4；CTD-2246P4.1、Linc00917； AC005082.12；miR-132、RP11-38F22.1)[15]。随着生物信息学的发展，结合一些通用的数据库可以建立LncRNA-miRNA-mRNA共表达的竞争性内源RNA网络，能够找出更多LncRNA与疾病的关键靶点，为进一步学术研究和临床应用提供有价值的参考。

3 LncRNA与LDD的机制研究

通常情况下，LDD是由于髓核内酶类的分解代谢速度大于合成代谢速度所致，而在退变的早期，往往出现细胞外基质中Ⅱ型胶原合成增加，在椎间盘受损区出现典型的“细胞簇”的特征，这些细胞密度升高，但活性细胞数量较少、细胞周期紊乱，细胞呈现过度增殖，可能揭示早期由细胞介导的对LDD和不正常机械应力损伤等因素导致的进展性结构破坏的异常反应[16]。随着椎间盘的退化，椎间盘细胞发生巨大的生物学变化，包括细胞类型转换、细胞老化、凋亡加速等细胞表型改变，这些变化通过复杂的相互作用参与了椎间盘变性的过程，致使椎间盘分解代谢增强，并逐渐丧失合成细胞外基质成分的能力，炎症反应随之被激活[17]。具有活性的LncRNA可以通过直接调控髓核细胞活动相关的靶基因或竞争miRNA调节细胞增殖、凋亡、衰老、自噬、细胞外基质的合成以及降解等诸多细胞过程[18]。

3.1细胞增殖相关LncRNA

3.1.1RP11-296a18.3 编号为RP11-296a18.3的LncRNA在人退变的髓核细胞中显著上调，短发夹RNA转染干扰实验显示，髓核细胞的活性及DNA的合成能力被抑制，Ⅰ型胶原蛋白和MMP-13的表达减少；利用生信预测数据库miRCode得到RP11-296a18.3潜在的结合靶点miR-138，LncRNA RP11-296a18.3通过类似“分子海绵”的形式，内源性竞争吸收miR-138，而miR-138可与缺氧诱导因子1α结合，活化细胞增殖的miRNA；进一步研究表明，RP11-296a18.3通过与miR-138结合形成异常增殖的细胞簇，进而刺激细胞外基质的分解代谢，并加速髓核细胞的退变过程[19]。

3.1.2小核仁RNA宿主基因1(small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1)和线粒体RNA处理核糖核酸内切酶RNA(RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease，RMRP) 外源性调节的LncRNA SNHG1和RMRP被证明在LDD中的表达均上调，SNHG1通过抑制miR-326促进了髓核增殖细胞核抗原和细胞周期蛋白D1的表达，促进细胞增殖[20]；RMRP在椎间盘中的异位表达，可靶向调节miR-206，减少MMP-13和ADAMTS-4的表达，促进Ⅱ型胶原和蛋白聚糖合成，同时促进髓核细胞增殖相关的核抗原Ki-67和细胞周期蛋白D1的表达，且RMRP在LDD后期的表达水平更高[21]。LncRNA SNHG1与RMRP对LDD的发生、发展具有积极作用，但两者表现出上调的趋势，一个可能的原因为过度增殖的细胞形成异常细胞簇加速退变；另一方面可能由于LncRNA之间存在反馈调节机制，SNHG1与RMRP的细胞保护机制拮抗其他促退变的LncRNA，保护椎间盘免受过度的损伤。

3.1.3肺腺癌转移相关转录子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)和核富集转录本(nuclear enriched abundant transcript，NEAT)1 MALAT1又称NEAT1，在不同的细胞过程中发挥不同的生理功能，如选择性剪接、核组织和基因表达的表观遗传学调控[22]。与对照组相比，退变的髓核细胞中MALAT1的表达显著减少，MALAT1低表达的退变髓核细胞中胱天蛋白酶(caspase)3的活性(凋亡标志物)增加，细胞增殖受到抑制，IL-1和IL-6的分泌增加，而上调MALAT1基因表达可抑制炎症反应和髓核细胞凋亡，促进细胞增殖，减轻LDD[23]。另一相似转录本LncRNA NEAT1在LDD中的表达则呈现相反的结果，NEAT1、p53、p21的表达均显著上调，通过调节ERK/MAPK信号通路促进分解代谢过程中MMP-13和ADAMTS-5的表达，使合成代谢中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖表达下调、凋亡细胞水平升高，而通过转染特异性干扰RNA可逆转这一效应[24]。LncRNA NEAT通过阻止髓核细胞外基质降解和细胞凋亡过程，有望成为LDD治疗的新靶点。

3.2细胞凋亡相关LncRNA

3.2.1生长阻滞剂特异性转录本5(growth arrest-specific transcript 5，GAS5) GAS5作为一种编码多种小核仁RNA的LncRNA，主要具有生长抑制和促进异常炎症细胞凋亡的作用。GAS5在LDD的表达显著上调，在线数据库miRBase确认GAS5的miRNA结合靶点为miR-155，应用实时定量聚合酶链反应测定基因表达量，蛋白印迹实验测得细胞增殖及凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)、caspase-3表达，利用Annexin V/PI膜核双染色法测定细胞凋亡率，结果显示，对照组的凋亡率低于GAS5过表达组[(35.4±1.86)%比(42.6±2.23)%](P<0.05)，提示LncRNA GAS5可能通过靶向结合miR-155，上调细胞凋亡蛋白caspase-3，从而诱导早期髓核细胞凋亡[25]。

3.2.2人类同源转录因子反义RNA (human homeobox transcription factors antisense intergenic RNA，HOTAIR) HOTAIR定位于第12号染色体HOXC11和HOXC12之间，是最早被发现的具有反式作用的基因间LincRNA[26]。研究表明，HOTAIR在LDD的髓核组织及TNF-α诱导的髓核细胞退变模型中均显著低表达；经TargetScan系统预测得知，miR-34a是HOTAIR内源竞争的miRNA，而miR-34a的关键靶点是与细胞凋亡密切相关的Bcl-2基因，Bcl-2蛋白通过抗氧化损伤或作为通道蛋白等方式保护细胞免于损伤或凋亡，Bcl-2相关X蛋白及caspase-3有拮抗Bcl-2的保护效应，可使细胞趋于死亡；经转染过表达HOTAIR基因到TNF-α诱导退变髓核细胞后，细胞凋亡率降低、Bcl-2增加、Bcl-2相关X蛋白、caspase-3相对减少，表明HOTAIR能够通过miR-34a/Bcl-2轴抵抗TNF-α诱导的髓核细胞损伤效应[27]。HOTAIR的表达减少预示着LDD过程中髓核组织的自我保护机制受损，凋亡效应占主导作用。

3.2.3DNA聚合酶ε(DNA polymerase epsilon，PolE) PolE由PolE1、PolE2、PolE3和PolE4四个单元组成。正常情况下，细胞需要维持一定的DNA甲基化状态，才能稳定有序调控非编码RNA和基因的表达，DNA甲基化状态决定了LncPolE水平，而LncPolE水平又能负调控DNA或染色质中组蛋白的活动，LncPolE水平升高可抑制PolE1的表达，影响PolE1复合物的稳定性，诱导细胞凋亡[28]。Li等[29]的研究表明，在铁含量降低的情况下，LncRNA启动子区域的组蛋白乙酰化和DNA甲基化异常，可导致PolE1的转录下调，从而激活髓核细胞凋亡信号，最终导致LDD的发生，这一系列表观遗传上的变化与LncPolE存在密不可分的联系，通过额外补充和消耗髓核组织中的铁元素，LncPolE水平随铁含量的升高而下调，并通过二价铁转运体1或转铁蛋白受体1的剔除进一步得以证实。这是第一个由金属阳离子调控的LncRNA，这一发现提出了另一具有创新性的研究思路，为从微量元素角度解决LDD提供了新的可能。

3.3细胞衰老相关LncRNA

3.3.1H19 人年龄的增加也是LDD重要的影响因素，髓核细胞的衰老普遍存在。由于受到长期持续外界环境刺激以及椎间盘自身无血管条件下局限的营养供应，导致髓核细胞含量较少，细胞代谢过程中通过氧化磷酸化产生能量、氧化应激，进而导致促炎因子(包括TNF-α和ILs)诱导产生副产物活性氧类成分，进一步加剧了髓核细胞衰老及退变[30]。衰老相关β半乳糖苷酶在衰老细胞中的活性显著增加，是实验检测细胞衰老的特异性标志物。基于GEO数据库的GSE56081芯片得知，LncRNA H19在LDD中的表达显著升高，在线平台miRanda、miRWalk、RNA22和Targetscan预测并证实了H19作为一种转录后调节因子通过海绵内源性RNA竞争方式结合miR-22，促进淋巴强化因子1的表达；另外，过氧化氢诱导的髓核细胞衰老模型、基因敲除、过表达及信号通路实验证明，H19通过激活Wnt/β-catenin信号通路，诱导细胞衰老过程中淋巴强化因子1、Myc、细胞周期蛋白D1蛋白的表达，促进分解酶MMP-2、MMP-3、MMP-9以及ADAMTS-5和Ⅰ型胶原的增加，抑制细胞增殖，在LDD进展中发挥重要作用[31]。

3.3.2牛磺酸上调基因1 (taurine up-regulated gene 1，TUG1) 另一在细胞衰老模型中发挥重要作用的TUG1也被证实能够通过激活Wnt/β-catenin通路抑制细胞增殖，而髓核细胞衰老的标志物衰老相关β半乳糖苷酶的活性增加，可加速炎症因子的产生以及细胞的衰老[32]。沉默H19、TUG1或使用特异性Wnt/β-catenin信号阻滞剂可阻断营养缺乏或炎症诱导髓核细胞衰老过程，为LDD的临床治疗提供了理论依据。

3.4细胞自噬相关LncRNA——Linc00641 细胞自噬是真核生物进化中保守地对细胞内物质进行周转的过程，它将非必需的分子或损坏的细胞成分通过自噬小泡隔离，使溶酶体在各种应激刺激下降解并得以循环利用，这一过程主要由自噬相关基因(autophagy related genes，ATG)调控。以往的研究中，衰老大鼠和退变的椎间盘中髓核细胞自噬水平升高，异常的机械压缩、高糖、乳酸超载、葡萄糖胺、活性氧类和营养缺乏等多种应激均会激活自噬反应，miR-153-3p能够降低ATG的表达水平，靶向抑制自噬程序，进一步说明自噬调节可能是椎间盘病变的诱因之一[33]。Wang等[34]研究发现，Linc00641是来自基因间与自噬相关的LncRNA，采用透射电镜、蛋白印迹实验和绿色荧光蛋白轻链3检测自噬活性，并利用Pull down和RNA荧光原位杂交技术对Linc00641靶点及定位进行验证，结果显示，Linc00641通过海绵竞争miR-153-3p，影响低营养诱导的LDD模型中ATG基因及蛋白的表达，加速细胞自噬及细胞死亡，最终导致LDD的级联破坏反应。

3.5细胞外基质降解相关LncRNA——LincRNA ADAMTS-5 LincRNA ADAMTS-5(LOC105372760)作为一种基因间反义表达的转录调控RNA，在LDD中的表达下调，用生物素化的Linc-ADAMTS-5进行Pull down实验，然后进行质谱分析，寻找到潜在的与Linc-ADAMTS-5相互作用的蛋白，与之相关的Ras响应元件结合蛋白1 (Ras responsive element binding protein 1，RREB1)是调节ADAMTS-5在髓核细胞表达的关键转录因子，剪接因子脯氨酸/谷氨酸是被证明与LincRNA ADAMTS-5相互作用的结合蛋白，Linc-ADAMTS-5与脯氨酸/谷氨酸蛋白结合后，促进RREB1招募至ADAMTS-5启动子内的结合位点，从而诱导染色质重构，导致髓核细胞中组蛋白去乙酰化，抑制ADAMTS-5的表达[35]。另外，通过R2、JASPAR[36]、Genomatix[37]数据库以及RNA免疫共沉淀、体外结合分析进一步证实，LDD中下调的Linc-ADAMTS-5与RREB1协同可促进ADAMTS-5的表达，促进髓核组织细胞外基质的降解，加速LDD的进程。

3.6炎症因子调节相关LncRNA——人类白细胞抗原复合体18(human leukocyte antigen complex group 18，HCG18) HCG18是长度为2 430 bp的LncRNA，在椎间盘突出患者的髓核组织中表达上调，并与突出的严重程度呈正相关；通过生物信息方法starBase v2.0预测得知，miR-146a-5p通过抑制TNF受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6)的表达，阻断激活NF-κB的信号通路，从而抑制巨噬细胞的侵入和细胞凋亡；HCG18还可通过抑制miR-146a-5p的功能，发挥多种导致细胞凋亡及炎性调节的功能[38]。Xi等[39]通过体外TNF-α诱导的髓核细胞退变模型实验证明，HCG18与TRAF6呈正相关，而TRAF6能够阻止HCG18介导的髓核细胞生长抑制；质粒转染过表达与基因干扰实验证明，HCG18可促进髓核细胞凋亡、巨噬细胞侵袭、碱性磷酸酶含量升高以及成骨分化中矿化结节增加，HCG18通过miR-146a-5p/TRAF6/NF-κB的炎性调节轴，抑制了髓核细胞的生长，促进髓核退变过程中炎症反应的积累，加速LDD的进展。

4 小 结

LncRNA在局部组织具有高度特异性，作为检测疾病的生物标志物具有相当可靠的价值。细胞焦亡作为一种新的程序性细胞死亡方式，与细胞凋亡、坏死等不同，其主要依赖于caspase-1形成多种caspase炎症小体，并伴有大量促炎因子及消解酶的释放。有研究表明，LncRNA H19、MALAT1、NEAT1分别参与视网膜神经胶质细胞损伤[40]、糖尿病肾病[41]、自身免疫反应[42]等的细胞焦亡过程。这些常用于学术研究的LncRNA在椎间盘髓核组织中的表达也存在差异，进一步从细胞焦亡的角度进行深入研究，能够开拓出LncRNA在LDD机制中的新思路。