程序性坏死参与特发性肺纤维化的研究进展

李思佳，李文新综述，宋新宇审校

0 引 言

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是以肺泡上皮细胞损伤和成纤维细胞增生为特征的一类间质性肺疾病，研究报道IPF患者的中位生存期仅为2～3年[1]。其主要死亡原因是呼吸衰竭，在IPF发病过程中过多的成纤维细胞和肌成纤维细胞的形成以及细胞外基质的沉积，导致了永久性瘢痕的产生，严重制约了肺泡的氧气交换能力[2]。肺泡上皮细胞的损伤主要由外界刺激或免疫反应过度激活引起细胞凋亡和坏死所导致。而既往研究认为坏死是过度刺激导致的不受调控的死亡模式，因此无法调控肺泡上皮细胞的坏死发生。然而最近研究发现，至少有部分坏死是受基因调控的程序性死亡，不仅可导致炎症反应，还可加剧慢性组织重塑，被称之为程序性坏死[3]。目前，程序性坏死在缺血性脑卒中、心肌缺血再灌注损伤以及急性肾损伤等疾病中被广泛研究，最近也有研究报道了程序性坏死参与慢性阻塞性肺疾病和急性呼吸窘迫综合征[4-5]。然而，程序性坏死参与IPF的发病及进展的机制仍未阐明。因此，本文将对程序性坏死的发生机制及其参与IPF发生发展的研究进展作一综述。

1 程序性坏死

1.1 程序性坏死的发生机制程序性坏死与凋亡和自噬均是受基因调控、高度有序的细胞程序性死亡。其中，凋亡和自噬受细胞膜表面受体或细胞器信号分子激活后，引起细胞内部蛋白或受损细胞器水解，通过形成凋亡小体和自噬小体防止细胞内免疫复合物直接泄露至细胞外，并可被巨噬细胞吞噬后进行降解和循环利用，是一种保护性的死亡方式。在凋亡和自噬的发生过程中细胞膜可保持完整，而程序性坏死的发生不仅会引起细胞膜快速破裂还因缺少蛋白水解过程，从而引起强烈的炎症反应并进一步诱导周围细胞损伤或死亡[6]。程序性坏死的病理学特征类似于坏死，以组织水肿、细胞质膜迅速破裂、释放大量内源性损伤相关分子引起急性炎症反应为主，因此其发生可导致周围细胞及组织的损伤或后续组织的纤维化增加。但其发生机制类似于凋亡和自噬，其关键生物学行为均经由特定程序和相关蛋白所主动执行，如质膜破裂、氧化应激、线粒体通透性转换孔的过度开放以及形成损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)等[7]。因此程序性坏死被认定为是一种可调控的细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)，通过干预其发生的关键靶点可调控细胞的死亡、炎症浸润以及纤维化形成。

程序性坏死的启动依赖于死亡受体途径，主要由细胞膜上的死亡受体Fas、肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor, TNFR)以及Toll样受体等受到相关配体激活后，进一步在细胞内募集Fas相关死亡域和TNFR相关死亡域形成死亡复合物，从而激活存在胞质内的受体交联蛋白酶1(receptor-interacting protein kinase, RIPK1)[8]。RIPK1是程序性坏死的启动蛋白，其通过RIP同型作用域结合并磷酸化或泛素化激活下游蛋白RIPK3。随后，RIPK3进一步磷酸化激活程序性坏死的重要执行蛋白混合谱系激酶结构域(mixed lineage kinase domain like, MLKL)。MLKL一般存在于细胞质内，在被激活后多个MLKL形成寡聚化复合物并转位至细胞膜，与细胞膜磷脂酰肌醇磷酸酯结合后形成细胞膜孔洞，导致钙离子外流和钠离子内流，不仅会引起细胞水肿，还会最终导致细胞内未充分水解的细胞器、带有免疫原性的DAMPs以及过氧化物等释放出胞，进而引起周围组织损伤和免疫炎性系统激活[9]。此外，RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路的激活可上调TNF-α、IL-1、单核细胞趋化蛋白1等炎症因子的表达，同时可促进转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)和α-肌动蛋白的表达，这不仅介导了炎症反应，还促进了纤维化的发生[10]。然而，这些促纤维化因子的分泌增加了肌成纤维细胞的激活，促进了肺泡细胞外基质的沉积，并破坏了正常肺泡的气体交换功能。目前，用于治疗IPF的吡非尼酮的主要作用机制就是抑制TGF-β和成纤维细胞生长因子等促成纤维细胞增殖和胶原合成的因子表达，从而显著防止和逆转肺纤维化和瘢痕形成[11]。因此，程序性坏死的发生可能参与IPF中细胞死亡、炎症浸润以及纤维化形成。

2 程序性坏死与IPF

IPF的发生主要是肺泡上皮细胞在多种致病因素刺激下发生损伤后引起进行性纤维化肺泡炎，而肺间质的广泛纤维化形成导致肺组织增厚，并造成肺组织的氧气交换功能不可逆地丧失。其具体病因尚不清楚，但与其风险因素香烟烟雾(cigarette smoke, CS)、全身炎症反应激活以及家族遗传有关。Lee等[12]在博来霉素灌洗来构建的小鼠肺纤维化模型中发现，在IPF小鼠的肺组织中RIPK3和p-MLKL表达显著升高，而与野生型小鼠相比，RIPK3敲除小鼠肺部纤维化和胶原沉积情况被显著改善，并且在肺泡灌洗液中DAMPs的水平显著降低，证明了程序性坏死的发生与肺纤维化的形成有紧密联系。

2.1程序性坏死介导的炎症反应与IPF程序性坏死的典型特征是释放DAMPs，可通过结合模式识别受体而触发免疫炎症反应。正常情况下肺泡间质有巨噬细胞存在而少有淋巴细胞存在，在IPF患者肺泡周围观察到淋巴细胞比例明显升高，其中T细胞是主要的效应细胞[13]。研究表明，肺泡周围的巨噬细胞吞噬细胞碎片或颗粒的情况下不会激活炎症反应，但在吞噬DAMPs的情况下会引起强烈的炎症反应，并会作为抗原呈递细胞介导T细胞的活化和浸润，进而分泌TGFγ、IL-2、IL-25、IL-13等驱动胶原蛋白沉积，导致肺纤维化[14]。因此，程序性坏死发生释放的DAMPs被认为是介导免疫炎症激活的重要因素。

吸烟是IPF的独立危险因素，与不抽烟IPF患者的4年中位生存期相比，有较长抽烟史患者的中位生存期缩短至3年[15]。Pouwels等[16]发现，CS的暴露可诱导支气管上皮细胞发生程序性坏死和释放DAMPs，这导致了大量促炎因子的释放，体内实验证实了香烟的暴露是通过程序性坏死发生而诱导中性粒细胞在气道浸润，而香烟烟雾对气道的刺激可被Nec-1所阻断。其中，HMGB1是程序性坏死释放的DAMPs中的重要因子。Hamada等[17]发现IPF患者的肺泡灌洗液中HMGB1水平明显高于非IPF患者，并且在小鼠IPF模型中发现了HMGB1的水平不仅与炎症水平有关，还与肌成纤维细胞形成和胶原沉积有显著关系，而抗HMGB1的抗体或丙酮酸乙酯均可抑制HMGB1水平从而减轻肺部炎症和纤维化程度。因此，CS可通过程序性坏死释放DAMPs引起免疫炎症发生，可能还参与了纤维瘢痕的形成，最终促进了IPF的疾病进展。

RIPK1-NF-κB的信号传递可促进多种炎症因子在细胞核的转录[18]。NF-κB是调节天然免疫应答的关键蛋白，在细胞受到死亡受体激活的信号后，RIPK1充当支架蛋白协同IKK泛素化修饰IκB从而使IκB被泛素-蛋白酶体所降解，从而释放出NF-κB二聚体进而进入细胞核，启动相关蛋白转录[19]。Tian等[20]发现，与对照组相比，IPF模型组的肺泡组织中NF-κB信号通路相关因子均被磷酸化激活，而NF-κB通路激活的促进了TNF-α、pro-IL-1β、IL-6、趋化因子以及集落刺激因子等一些促炎症因子的生成，因此在程序性坏死发生过程中，NF-κB的过度激活被认为是促进免疫炎症发生的主要因素。此外，RIPK3作为程序性坏死重要蛋白不仅可以激活MLKL介导细胞膜的破裂，还可招募炎症小体NLRP3，继而水解pro-Caspase-1，将其转化为活性Caspase-1，进而活化由NF-κB转录生成的pro-IL-1β和IL-18[21]。研究发现，在博来霉素诱导的肺纤维化模型中，NLRP3和IL-1β的水平显著升高，上调了IL-1受体的表达，介导了肺组织的慢性炎症和纤维化[22-23]。有趣的是，这个过程在病灶周围的巨噬细胞中广泛发生，这可能会导致炎症状态的持续存在[24]。因此，程序性坏死的发生不仅可通过释放DAMPs激活免疫系统促进炎症反应，还可通过促进内源性炎症因子的生成加剧炎症反应。

2.2程序性坏死介导的纤维化与IPFIPF患者的肺纤维病灶中以肌成纤维细胞为主，而正常健康人的肺间质主要以少量成纤维细胞存在[25]。研究发现IPF患者的成纤维病灶中有较高水平的TGF-β表达，且大量体外实验证实了TGF-β是诱导成纤维细胞分化为α-SMA阳性的肌成纤维细胞的关键[26]。尽管肌成纤维蛋白的形态和生长特性和成纤维细胞差别不大，但高表达外分泌蛋白GM-CSF、IL-6、IL-8、MCP-1等促炎因子，从而趋化成纤维细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等聚集在纤维病灶，最终促进大量成纤维细胞分化为肌成纤维细胞[27]。

在IPF动物模型中，CS可引起内质网应激促进成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，表现为α-SMA的表达显著升高，而使用内质网抑制剂4-PBA或GRP78抑制ERS可逆转α-SMA的表达，证明CS促进成纤维细胞分化为肌成纤维细胞的过程依赖于内质网应激的发生[28]。最近研究通过共聚焦显微镜观察到RIPK3在被激活后可转位至内质网外膜，不仅可导致ERS的发生，还可引起肌质网功能紊乱而导致细胞内钙超载，该研究证明了ERS的发生至少有部分是由程序性坏死发生而RIPK3激活并转位至ER外膜所导致的[29]。因此，我们合理地猜测在IPF过程中，CS诱导的程序性坏死的发生可引起ERS，从而促进成纤维细胞分化为肌成纤维细胞。另外，Hou等[30]发现，TNF-α可通过激活NF-κB信号通路促进肺间质干细胞大量分化为肌成纤维细胞，而NF-κB的活化依赖于RIPK1。在博来霉素诱导肺纤维化模型中，抑制NF-κB信号通路可显著减少肺间质干细胞分化为肌成纤维细胞，并明显地改善了肺纤维化。以上研究证明，程序性坏死可通过调控ERS和NF-κB信号通路，促进大量成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，因此靶向干预程序性坏死可能是阻断肺间质纤维化的有效策略。

2.3程序性坏死与家族性IPF部分IPF患者具有明确的家族遗传史，研究发现在吸烟史、性别因素和环境暴露因素无显著差异的情况下，与单发性IPF患者相比，家族性IPF患者发病年龄更早(55.4岁vs63.2岁，P<0.001)，平均死亡年龄更小(67.0岁vs71.8岁，P=0.059)，尽管两组间平均死亡年龄不具有统计学差异，但作者认为这可能与家族性IPF患者更早诊断和及时服用抗纤维化药物有关[31]。Takezaki等[32]在2例日本家族性IPF患者中检测到SFTPA1基因位点的纯合子突变，导致了下游编码蛋白产物表面蛋白A(surfactant protein A, SP-A)分泌显著减少，并且这些患者更易感染流感病毒病加速IPF的进展。为明确SFTPAP1突变与IPF的关系，他们构建了SFTPAP1纯合敲除小鼠，在SFTPAP1-/-小鼠的肺泡II型上皮细胞中检测到RIPK3和MLKL的过表达，而敲除RIPK3或MLKL均可显著改善IPF的进展，这证明了SFTPAP1纯合突变体不仅减少了SP-A的产生，还会导致程序性坏死的发生失去监控。进一步地，他们发现SFTPAP-1的缺失可导致ERS，从而过表达IRE1α和增加JNK磷酸化，从而上调了RIPK3表达，抑制IRE1α和JNK可显著抑制RIPK3的表达并阻止肺纤维化进程。相反，以上的过程可被RIPK3过表达所逆转，证明了家族遗传史可能增加了IPF对外界刺激的易感性，而程序性坏死加剧了肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤和纤维化过程。

3 结 语

综上所述，程序性坏死参与了IPF进展过程中的免疫炎症激活和纤维化增生，介导了吸烟和家族遗传史加剧IPF发生的重要过程，因此程序性坏死可能是治疗IPF的重要靶点。另外，程序性坏死相关基因的多态性可能与多种疾病的发展和患者预后显著相关，是否程序性坏死关键蛋白的基因多态性可作为判断IPF发生和预后的预测因子仍需进一步阐明。值得注意的是，目前的研究多基于细胞模型和动物模型，是否同样适用于临床治疗仍需进一步调查。程序性坏死相关的信号通路和分子靶标仍未被充分发现，因此程序性坏死的特异性和敏感性较高的生物标志物尚未被充分建立。此外，目前尚缺少IPF患者肺组织异常表达程序性坏死的生物学标记证据，以及相关血清学检查。进一步地完善这些研究对治疗IPF具有较大临床意义。