昆虫抗菌肽免疫调控作用及机制研究进展

许晓燕综述，夏 嫱审校

0 引 言

免疫系统在机体识别和清除外来病原微生物中发挥重要作用，分为固有免疫系统和适应性免疫系统。由于昆虫在长期生物进化中所形成的地位，使其免疫系统与脊椎动物的免疫系统不同，只有固有免疫系统，细菌、病毒或药物等刺激会启动昆虫的免疫系统。昆虫体内因不同刺激而产生的免疫物质称为抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)[1]。昆虫抗菌肽作用广泛，尤其免疫调控方面的研究备受关注[2]。

1 昆虫抗菌肽概述

在抗菌肽研究中，昆虫抗菌肽的研究起步最早，科学家们最先发现的抗菌肽是从鳞翅目昆虫惜古比天蚕(Hyatophoracecropia)中发现的，命名为天蚕素[3]。目前在抗菌肽数据库(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)中可以查到的昆虫抗菌肽约有310种。根据抗菌肽的结构和功能的差异，昆虫抗菌肽大致可分为3类，分别为天蚕素类、防御素类及富含脯氨酸或甘氨酸类。①天蚕素类(cecropia)昆虫抗菌肽：因最初从惜古比天蚕体内获得而得名，目前天蚕素类抗菌肽多从鳞翅目和双翅目昆虫体内提取，已知的主要天蚕素类抗菌肽有天蚕素A、天蚕素B和天蚕素D，主要由35～37个不含半胱氨酸的氨基酸残基组成[4-6]，对革兰阳性(G+)菌和革兰阴性(G-)菌均有抑制作用[7-8]；②防御素类(Defensins)昆虫抗菌肽：此类抗菌肽不是昆虫独有的抗菌肽，但是在双翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目等昆虫体内均提取到了不同类型的防御素[9]，主要由氨基酸和半胱氨酸残基组成[10]，昆虫防御素对G+菌和G-菌均有作用，尤其对金黄色葡萄球菌等G+菌抑制作用更为明显[11-12]；③富含脯氨酸或甘氨酸类昆虫抗菌肽：富含脯氨酸的抗菌肽因结构中含有丰富的脯氨酸而得名，主要有凝集素(Lebocins)、果蝇菌素(Drosocin)和Metchnikowin等抗菌肽[13]。富含甘氨酸的抗菌肽主要有攻击素(Attacins)、双翅菌肽(Diptericins)等抗菌肽。此类抗菌肽能够抑制大多数G-菌以及有选择性的抑制某些G+菌的繁殖[14-16]。

昆虫抗菌肽具有抑制细菌繁殖、抗病毒、抗真菌及抗寄生虫等多种作用[17-18]。昆虫抗菌肽不仅具有抗微生物活性，还具有抗肿瘤活性，如克隆自美国白蛾的抗菌肽ABP-dHC-Cecropin A及其类似物能有效杀伤白血病细胞[19]，蜜蜂的蜂毒肽对胃癌细胞具有较强的细胞毒性[20]，家蝇幼虫抗菌肽粗提物作用于人肝癌HepG2细胞后会导致HepG2细胞核变形，线粒体膜电位降低[21]，来自果蝇的抗菌肽可以与肿瘤坏死因子联合作用杀死荷瘤果蝇幼虫体内的肿瘤细胞[22]。除此之外，昆虫抗菌肽还具有免疫佐剂作用，陈立青[23]研究证实，家蝇幼虫抗菌肽可作为免疫佐剂提高卵白蛋白(OVA)免疫小鼠体内IgG抗体效价、促进脾细胞增殖以及提高NK细胞的杀伤能力。近年来随着对抗菌肽的深入研究发现昆虫抗菌肽在免疫调控中作用越来越重大[2,24]。

2 昆虫抗菌肽的免疫调节作用

从鳞翅目、双翅目、膜翅目及鞘翅目昆虫体内提取的抗菌物质均具有良好的免疫调节作用，如激活免疫细胞、诱导细胞因子产生等[25]。

2.1鳞翅目昆虫的免疫调节作用鳞翅目昆虫主要包括蛾类和蝶类等昆虫，对此目昆虫抗菌肽的研究主要集中在蛾类昆虫。Wang等[26]在柞蚕蛾(Antheraeapernyi)体内提取到了天蚕素B，将天蚕素B的铰链区切除而获得一种新型的抗菌肽-天蚕素DH。10 mmol浓度下抗菌肽-天蚕素DH能够有效抑制RAW264.7细胞中一氧化氮合酶(iNOS)、一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β和IL-6的表达，尤其对NO的抑制率达到了85%。天蚕素A亦可以有效抑制NO的产生，且具有一定的浓度依赖性。当天蚕素A的浓度达到5μmol时，可以完全抑制NO的产生，浓度达到25 μmol，不仅能够抑制NO的产生，还能够显著抑制炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β和小鼠巨噬细胞炎症蛋白(MIP)- 2 抗体mRNA的表达，从而发挥抗菌肽的抗炎作用[27]。将家蚕体内富含甘氨酸的抗菌肽(Bombyx mori gloverin A2，BMGlvA2)作用于炎症小鼠后可以有效减少小鼠脾的损伤、坏死以及脾脏内淋巴细胞和巨噬细胞的数量，同时高剂量的BMGlvA2(8.0mg/kg)还可以显著降低炎症小鼠体内的炎性细胞因子 IL-1β、IL-6和 TNF-α的表达，从而减轻小鼠的炎症反应[28]。

2.2双翅目昆虫的免疫调节作用双翅目昆虫抗菌肽免疫调节的研究主要集中在蝇类、虻类、蚊类等昆虫，其中对家蝇的研究最为广泛。在金黄色葡萄球菌刺激下，转导重组家蝇抗菌肽A2(Mdc-A2)慢病毒表达载体的RAW264.7细胞株(RAW-Mdc-A2)与未转导Mdc-A2的RAW264.7细胞株相比，其TNF-α转录变异体1、2(TNF-α-tv-1、TNF-α-tv-2)的mRNA表达以及TNF-α的含量均显著降低，同时还能下调IL-1β mRNA的表达[29]。

从家蝇幼虫体内提取的抗菌肽MDPF不仅具有促进脾细胞增殖、提高小鼠体内自然杀伤(Natural killer, NK)细胞和细胞毒性T淋巴细胞活性的作用，还可以提高S180荷瘤小鼠血清中肿瘤抗原特异性免疫球蛋白(Ig)G、IgG2a和IgG2b抗体水平。MDPF对S180荷瘤小鼠脾细胞中干扰素(Interferon, IFN)-γ和Th1转录因子T-bet、STAT-4的mRNA表达也有明显的促进作用[30]；Chen等[31]研究亦发现，MDPF不仅可以增强由刀豆蛋白A、脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)等刺激的脾细胞增殖和NK细胞的活性，显著提高由OVA和rL-H5免疫小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b的滴度，还能显著促进免疫小鼠脾细胞产生Th1(IL-2和IFN-γ)和Th2(IL-10)细胞因子。将从马蝇唾液中提取的天蚕素-TY1(cecropin-TY1)以及从黑蝇唾液腺中提取的抗菌肽SibaCe分别注射到不同小鼠腹腔中，发现两种抗菌肽均能够显著降低由LPS 诱导小鼠腹腔内巨噬细胞iNOS mRNA的表达以及NO的产生，同时还发现cecropin-TY1和SibaCec均能够抑制LPS诱导的细胞因子如TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的表达，并且具有一定的剂量依赖性[32-33]。

在对埃及伊蚊体内抗菌物质的研究发现，从埃及伊蚊体内提取的5种抗菌肽(AeaeCec1、2、3、4、5)在浓度为5 μmol时可有效抑制LPS刺激产生的iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。以小鼠为研究模型发现，AeaeCec1-5能有效降低内毒素休克小鼠模型中小鼠肺脏、血清和腹腔灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β的表达，且作用后小鼠肺损伤和水肿等症状与对照组相比均有所减轻。利用AeaeCec1-5治疗以大肠杆菌或铜绿假单胞菌感染的小鼠，发现其可以在一定程度上降低小鼠体内TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，同时还能够减少肺组织损伤等不良情况的发生。无论是对内毒素休克小鼠模型的研究还是其他模型的研究，均证实AeaeCec5是AeaeCec1-AeaeCec5中免疫调节能力最强的抗菌肽[34]。

2.3鞘翅目昆虫的免疫调节作用鞘翅目是昆虫纲中第一大目，对此目昆虫抗菌肽的研究主要集中在蜣螂以及双叉犀金龟等昆虫方面。Lee等[35]从蜣螂体内提取到了一种防御素类抗菌肽-coprisin，25 μmol的coprisin可以使RAW264.7细胞中IL-1β、MIP-1、iNOS mRNA的表达量下降50%以上。Kang等[36]研究coprisin类似物时亦发现，coprisin类似物可以明显降低由艰难梭菌(Clostridiumdifficile)引起的急性肠道炎症小鼠回肠组织提取物中IL-6含量，且小鼠的肠道炎症也得到有效改善。从蜣螂体内提取的另一种抗菌肽-CopA3，同样能够阻断梭状芽孢杆菌A诱导的小鼠肠道炎症，改善由2%葡聚糖硫酸酯钠(Dextran sulfate sodium, DSS)诱导的小鼠结肠炎症状，降低小鼠回肠中的IL-6和TNF-α含量[37]。除了蜣螂，Lee等[38]从双叉犀金龟(Allomyrinadichotoma)体内也提取到了一种抗菌肽-Allomyrinasin。Allomyrinasin能够降低RAW264.7细胞中NO、iNOS以及COX-2的含量，且具有浓度依赖性，200 μg/mL以上的Allomyrinasin可以有效抑制iNOS和COX-2蛋白表达以及降低IL-1β和IL-6含量。

2.4膜翅目昆虫的免疫调节作用膜翅目昆虫仅次于鞘翅目和鳞翅目，是昆虫目中第三大目，对于本目昆虫抗菌肽免疫调节的研究主要为蜂类、蚁类。在研究蜜蜂来源的抗菌肽Apidaecin对人单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞的影响时发现，Apidaecin能够上调T淋巴细胞共刺激分子CD80的表达，还能够抑制巨噬细胞主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex, MHC)II类和CD86含量的增加以及抑制巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β等细胞因子；对MIP -1 和巨噬细胞趋化肽(Macrophage chemotactic peptides, MCP)-1的产生亦具有一定的抑制作用[39]。不仅Apidaecin能够调节免疫活性，Apidaecin的一种衍生肽Api88亦能够浓度依赖性的降低促炎细胞因子TNF-α的产生，同时还能够提高抑炎细胞因子IL-10的含量，降低人单核细胞体内活性氧的产生。此外Api88还能够促进人肥大细胞脱颗粒，进而调节其细胞的生物活性[40]。在蚂蚁毒液中提取的阳离子抗菌肽P17不仅能够在体外诱导人单核细胞源性巨噬细胞释放活性氧和IL-1β，促进炎症的发生；还可以刺激小鼠体内巨噬细胞吞噬白色念珠菌以及产生活性氧和IL-1β，进而减轻小鼠胃肠道反应，从而治疗白色念珠菌感染小鼠[41]。

3 昆虫抗菌肽免疫调节机制

目前研究认为，昆虫抗菌肽在机体内发挥免疫调控作用主要通过3条信号通路进行，分别为Toll样受体信号通路、核转录因子-κB信号通路和丝裂原活化蛋白激酶信号通路[42]。当机体被外来病原体感染时，昆虫抗菌肽可以启动不同的通路来发挥其免疫调控作用。

3.1Toll样受体信号通路模式识别受体(Toll-like receptor, TLR)在抗菌肽的免疫调控中占据重要地位，是免疫调控的启动者[43]。TLR包括TLR1～TLR10，其中TLR1、TLR2、TLR4～6主要在免疫细胞表面表达，其余的TLR在细胞内表达。外界异物进入机体后，被免疫细胞表面的模式识别受体(TLR2、TLR4等)识别，从而启动细胞内信号的级联反应，如位于下游的NF-κB和MAPK信号通路。抗菌肽通过调控相关通路的表达，调节免疫细胞活性以及TNF-α、IL-6、IL-8等细胞因子的分泌，从而对机体的免疫系统进行调控。如从燕尾蝶(Papilioxuthus)体内分离到的抗菌肽Papiliocin能够抑制LPS与RAW264.7细胞表面的TLR4结合，从而阻止TNF-α和IL-1β等细胞因子的表达[44]。Wang等[24]研究发现天蚕素DH和天蚕素B抑制炎性因子的表达，可能是其能与LPS结合，进而阻止或者干扰LPS与TLR4的相互作用，最终抑制了与TLR4相关的下游信号的传导。从蜣螂体内提取到的Coprisn之所以具有抑炎作用，是因为它能够抑制LPS与TLR4结合，进而阻止其下游NF-κB的核易位[35]。

3.2NF -κB信号通路研究抗菌肽免疫调节机制的学者众多，目前认为核转录因子-κB(Nuclear Factor-κB, NF-κB)信号通路是免疫调节中的重要调控者[45]。在机体免疫应答中发挥着重要作用。研究发现，从黑蝇唾液中提取的抗菌肽SibaCec能够影响LPS诱导的炎症信号通路。LPS (100 ng/mL)能够诱导NF-κB中 p65亚基从细胞质向细胞核转移，而SibaCec (10 μg/mL) 对LPS诱导的NF-κB p65亚基移位有明显的抑制作用，说明SibaCec发挥其抗炎效果是通过抑制NF-κB炎性信号通路实现的[33]；Wei等[46]亦指出姚虻抗菌肽cecropin-TY1亦可以通过抑制NF-κB信号通路，来减少促炎细胞因子如TNF-α、IL-6的产生。从埃及伊蚊体内提取到的5种抗菌肽(AeaeCec1-5)均具有抑制NF-κB通路中p65磷酸化的作用，尤其是AeaeCec5的抑制率达到了90%以上[32]。Kim等[44]发现从燕尾蝶(Papilioxuthus)体内分离到的抗菌肽PapiliocinQian能够抑制NF-κB的表达，Qian等[28]亦发现高剂量的BMGlvA2 (8.0 mg/kg) 可以降低NF-κB通路的表达水平。

3.3MAPK信号通路抗菌肽发挥免疫调控作用的另一条重要通路是丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路，该通路广泛存在于各种动物细胞的信号转导途径中，包括JNK、p38和ERK三大类亚族。在研究黑蝇抗菌肽SibaCec对LPS诱导的炎症信号通路影响中发现，SibaCec(10 μg/mL)对LPS诱导的ERK和p38磷酸化具有明显的抑制作用[31]；经LPS(100 ng/mL)刺激后，小鼠腹腔巨噬细胞中JNK、ERK和p38的磷酸化表达水平显著增强。从埃及伊蚊体内提取到的五种抗菌肽(AeaeCec1-5)亦可有效抑制MAPK信号通路中JNK、ERK和p38蛋白的激活[34]；从天蚕中分离出来的一种新的抗菌肽CecropinA亦能够抑制MAPK通路中ERK、JNK和p38三种蛋白的磷酸化，从而抑制COX-2的表达，达到抗炎的目的[27]。

4 展 望

昆虫是地球上种类最多的生物，其抗菌肽的研究亦备受关注。目前，昆虫抗菌肽在抗菌、抗病毒、抗寄生虫及抗肿瘤等方面研究均取得了重大进展[17-23]。随着对昆虫抗菌肽应用的深入研究，发现其具有多种免疫调控作用。因昆虫抗菌肽在参与机体免疫调节时具有作用时间长、不良反应少、生物毒性低等特点，在免疫调节药物研发方面具有良好的应用前景。但是由于昆虫体内抗菌肽含量少，量产的可行性较低，而通过基因工程、化学合成等方法虽然能实现量产，但是高昂的成本也限制了抗菌肽研发。随着各领域对昆虫抗菌肽研究的深入有望提高其产量，并使其在免疫调控方面的应用取得新的突破。