免疫评分系统在肿瘤预后中的研究进展

朱鸿宇综述，许 林审校

0 引 言

随着发病率以及死亡率的不断上升，肿瘤已成为威胁人类生命健康的重要疾病，而我国已成为肿瘤发病率、死亡率第一的国家[1]。肿瘤的发生、发展受到环境、遗传因素、生活习惯等多种因素影响，而目前肿瘤的治疗包括手术、化疗、放疗、免疫治疗等多种手段，最终的目的是为提高患者的生活质量，延长生存时间。而预测患者的预后需要一个稳定的、准确的、国际通用的评价标准，并且依赖此标准可更好的进行肿瘤个体化治疗。目前临床上普遍采用TNM分期系统来评估患者的预后，但是越来越多的临床资料证实，相同TNM分期患者在术后接受同样的辅助治疗后，其术后生存期有显著差异，甚至部分早期的患者预后较分期更晚的患者预后差[2]。其可能原因是TNM评分系统未考虑到患者整体免疫状况，未分析肿瘤组织的微环境特征，不能准确而全面地评估患者预后。近年来国际上有学者提出使用免疫评分(Immunoscore)系统，即通过免疫组化技术将肿瘤微环境中的免疫细胞进行量化来预测肿瘤患者的生存期[3]。且国内外已有多项研究表明免疫评分系统对肿瘤患者临床预后的预测较TNM分期系统更准确，目前结直肠癌中的研究较多，在包括肺癌以及胃癌等多种肿瘤中均有研究。本文将对免疫评分系统的研究现状作一综述。

1 肿瘤微环境中免疫细胞浸润情况与肿瘤患者预后相关

肿瘤微环境是指肿瘤在发生发展过程中所处的内环境，包括肿瘤细胞及其周围的免疫细胞、肿瘤相关成纤维细胞、血管内皮细胞等。这些细胞以及细胞外基质之间相互作用，产生和释放各种细胞因子和其他介质，形成免疫抑制性的肿瘤微环境，这种环境促使肿瘤细胞逃逸机体的免疫监视，促进肿瘤的发生、发展以及转移[4]。其中肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)是在参与机体抗肿瘤反应中发挥着重要作用的淋巴细胞，主要包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞以及巨噬细胞、树突状细胞等[5]。在包括非小细胞肺癌[6]、乳腺癌[7]、胃癌[8]、结直肠肿瘤[9]等多种不同肿瘤中，肿瘤浸润免疫细胞的密度与患者预后存在显著的相关性，且大部分研究表明TILs密度与预后情况成正相关。

Galon等[10]研究人员通过基因表达谱和原位免疫组化染色发现肿瘤组织中免疫细胞的类型、密度、分布区域和表型激活状态对于预测肿瘤患者预后具有重要意义。以此为基础，将与肿瘤患者无病生存期(disease-free survival，DFS)和总生存期(overall survival，OS)相关的各种获得性免疫因素统称为“免疫结构”，即获得性免疫细胞在不同肿瘤区域的类型、功能定位、密度和位置[11]。免疫结构主要包含肿瘤中心区域和交界区域中的CD8+毒性T细胞、CD45RO+记忆性T细胞、三级淋巴结构、功能黏附相关分子(MADCAM1、ICAM1、VCAM1)、趋化因子(CX3CL1、CXCL9、CXCL10、CCL5、CCL2)、Th-1相关细胞因子(IFNG、Tbet、IRF1、IL12)、细胞毒性因子(颗粒溶解素、颗粒酶、穿孔素)等[12]。Galon 等[10]通过高通量结肠癌肿瘤微环境数据库发现，Th1获得性免疫相关的基因[CD3ζ、CD8、IRF-1、IFN-γ、T-bet、GZMB和颗粒溶解素等]表达升高与患者的术后良好预后相关，能够防止肿瘤复发。随后在包含415例结肠癌患者的组织芯片上使用免疫组化进行验证，研究发现在肿瘤核心(core of tumor，CT)区域与肿瘤浸润交界(invasive margin，IM)区域中，CD3、CD8、CD45RO和GZMB高表达的患者，拥有着更长的DFS和OS，即预后更好，且CT和IM两个肿瘤区域综合分析较单一区域准确性更高[10-11]。

2 免疫评分系统的建立与发展

2.1 免疫评分系统的建立基于肿瘤组织中免疫细胞浸润情况与肿瘤患者预后相关的研究结果，Galon等[13]提出免疫评分这一概念，即对肿瘤微环境中的免疫细胞的数量进行量化。通过大量的临床验证之后提议将免疫评分系统作为一个肿瘤预后因素，纳入传统的肿瘤分期系统，成为肿瘤常规诊断和预后评估的一个重要部分。

由多个专业实验室组成的国际共识小组经过跨实验室分析验证，得到结论：分析肿瘤组织的CD3、CD8、CD45RO和GZMB阳性的细胞数量是评价患者预后的最好选择，且这4个指标任意2个组合都可得到相似的统计功效。但因CD45RO背景染色和GZMB颗粒染色易丢失抗原信息以及其他一些技术难题未被选用，而CD3和CD8因为染色质量高且稳定被确定为标记物，最终研究人员选择CD3+和CD8+细胞在CT和IM这两个区域的定量作为免疫评分的依据[13-14]。主要评分步骤：两张切片分别进行CD3和CD8免疫组化染色，阳性细胞密度高计为1分，密度低计为0分，把CD3+和CD8+细胞在CT与IM区域的评分相加，得到总的免疫评分(0～4分)。

为促进免疫评分系统更快的应用到临床中，有研究于2012年建立了统一的检测流程标准，具体到样本和染色试剂的选取、扫描仪器和图像分析软件的型号以及具体评分细则，并寻求其他实验室合作，一起验证免疫评分系统的可行性[14-15]。同年，SITC牵头成立的免疫评分工作组，得到世界多地的肿瘤免疫治疗组织的支持和参与，随后来自亚洲、欧洲、北美、等地的17个国家的23个病理中心同意参加这个有远见的项目[14,16]。免疫评分工作组的首要目标是：①验证免疫评分的可行性和可重复性；②验证常规进行免疫评分在Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期结肠癌患者中评估预后的效能；③验证免疫评分在预测Ⅱ期结肠癌患者高复发风险中的作用。而工作组下一阶段的目标：①促进全球范围使用免疫评分作为癌症分类的常规检测指标；②验证免疫评分对其他类型癌症患者的主要预后作用；③证明免疫评分在临床试验中预测治疗反应的效用。

免疫评分工作组对3539例Ⅰ-Ⅲ期结肠癌患者进行了免疫评分，858例因质量控制被排除，700例纳入训练组，636例纳入内部验证组，1345例纳入外部验证组[17]。免疫评分高低的评价规则进一步明确，将每个结肠癌患者的CT和IM区域的CD3+和CD8+细胞密度在训练组和内部验证组的细胞密度进行比较并转换为百分位数，计算四个百分位(两个标记物，两个区域)的平均值并转换为免疫评分，将细胞密度0～25%评为低分，25%和70%之间评分为中，密度在70%和100%之间评为高分，若分为两类，则0～25%为低分，25%到100%为中高评分。主要发现如下：①免疫评分的结果在不同的病理中心和操作人员之间可以得到很高的重复性；②免疫评分越高，复发风险越低。在训练组中，免疫评分高的患者5年复发风险最低[高、中、低免疫评分组的5年复发率分别为8%、19%和32%，高分组与低分组的风险比(hazard ratio，HR) 0.20,95% CI: 0.10～0.38；P<0.0001]，一致的结果在两个验证组中得到了证实；③免疫评分是结肠癌复发的独立预测因子；④免疫评分对患者DFS和OS的预测价值比现有的肿瘤预后风险参数相对更好，包括TNM分期、MSI状态、血管淋巴神经侵犯、肿瘤分化程度等。该项研究证明了免疫评分系统在预测结肠癌患者复发风险、DFS和OS等方面的可行性、可重复性、有效性和稳定性。

2.2免疫评分系统的发展免疫评分系统在结肠癌中被证明是一个有效的预后指标，在其他多种类型的肿瘤中的预后作用也得到了验证。Yu等[18]对67例根治性膀胱切除术后的肌肉浸润性膀胱癌患者进行免疫评分，结果发现IM区域CD8+TILs的高密度与更好的预后相关，且免疫评分高分的患者拥有更长的DFS，该研究表明免疫评分是评价膀胱癌根治术后患者预后情况的一个潜在指标。Wang等[19]对249例肝转移结直肠癌患者的肝转移病灶进行免疫评分，发现免疫评分较高的患者的无复发生存期(relapse-free survival，RFS)和OS与免疫评分低的患者相比明显更长(P<0.001)，另外通过接受者操作特征曲线(Receiver operating characteristic curves，ROC)来比较免疫评分和临床风险评分系统(clinical risk score，CRS)对生存期预测的敏感性和特异性，发现在预测OS方面，免疫评分比CRS具有更好的预后价值(P=0.029)，表明对肝转移病灶的免疫评分可用于预测肝转移结直肠癌患者肝切除后的生存期。

由于不同肿瘤的发病机制以及微环境之间存在差异，除CD3和CD8，其他的一些生物标记物如PD-1、PD-L1等也被纳入到免疫评分系统的研究中，研究表明这些标记物也有较好的评价预后作用。Ishii等[20]筛选了36例II-III期非小细胞肺癌术后患者，通过免疫组化技术分析了这些患者的PD-L1表达及TILs密度情况，发现PD-L1表达与高免疫评分(3～4分)显著相关，且免疫评分4分的患者拥有明显更长的DFS。Paulsen 等[21]对总共536例I-IIIA期非小细胞肺癌患者构建了组织芯片，并利用免疫组化对这些患者的肿瘤原发灶和转移淋巴结的PD-1和PD-L1表达水平进行了分析，将肿瘤基质中PD-L1阳性细胞的密度(S-PD-L1)和肿瘤实质中PD-1阳性细胞密度(T-PD-1)情况联合起来称为PD免疫评分，结果表明PD免疫评分是一个独立预后因子，评分低的患者预后不良，疾病特异生存期(disease-specific survival，DSS)、DFS和OS均较短，将PD免疫评分加入到TNM分期系统中可更好的预测生存期。Chen等[22]选取了222例I-IIA期宫颈癌患者，利用免疫组化的方法对肿瘤细胞和免疫细胞的PD-1、PD-L1和CD8阳性的比例和强度进行定量，发现免疫细胞中PD-L1阳性，PD-1高表达的患者，DFS和OS均较短，而PD-L1阳性的肿瘤细胞中，CD8+T细胞浸润越多，患者的OS和DFS越长，这些免疫因子对生存期的预测效果比TNM分期系统更加准确，是很好的预后指标。Bosmuller等[23]对135名高级别浆液性卵巢癌患者肿瘤内的CD3和CD103阳性淋巴细胞的密度进行分析，发现CD3和CD103阳性淋巴细胞数量与OS显著正相关，特别是在最佳切除和铂类敏感的患者中，联合这两个标记物可很好地判断患者预后情况。Yao等[24]对乙型肝炎病毒相关的肝细胞癌的CT和IM区域CD3+、CD8+、CD45RO+T细胞进行定量，并进行免疫评分，发现免疫评分与OS显著正相关，且CD3、CD8与CD45RO这三个标记物任选两个均可起到评估预后的作用。以上研究表明在免疫评分的基础上，除CD3、CD8，其他的一些标记物在不同的肿瘤中也有较好的预后作用，可根据不同的肿瘤组织选取更加合适的标记物来评价患者的预后。

3 免疫评分在指导治疗中的价值

恶性肿瘤目前常见的治疗方式包括手术、放疗、化疗、分子靶向治疗、免疫治疗等，而且当前免疫治疗展现出很好的治疗前景，如西普鲁塞-T用于治疗前列腺癌[25]，伊匹单抗、纳武单抗用于治疗黑色素瘤[26]，以及多种免疫治疗药物用于非小细胞肺癌等[27]，但是免疫治疗只有部分患者有效，当前在治疗方案的选择上仍有很大的盲目性，所以预测患者对免疫治疗应答的情况非常重要，目前有研究表明免疫评分系统可对肿瘤患者进行分类，帮助寻找免疫治疗可能有效的患者，从而可更好的指导治疗。

Nie等[28]研究人员通过CIBERSORT算法构建免疫相关预测因子，来识别抗PD-1治疗黑色素瘤的应答者。筛选出8个标志物来构建免疫评分，发现免疫评分高的患者的客观反应率(objective response rates，ORRs)明显高于免疫评分低的患者(P<0.001)，且高免疫评分组的生存时间更长，此外，还发现高免疫评分组患者拥有更高的TILs比例和更好的干扰素IFN-γ应答，基因富集分析结果表明，免疫评分高的组抗肿瘤免疫相关通路显著富集。因此，该研究构建了一个稳健的免疫评分模型，可用来预测黑色素瘤的PD-1抗体治疗的应答情况。Yao等[29]通过免疫组化检测接受酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKI)治疗的转移性肾细胞癌患者的CD8、CD4、Treg、PD-1、PD-L1的表达情况，最终选取肿瘤组织CD8、Treg、PD-1和间质PD-L1的表达情况联合现有的IMDC风险模型作为免疫评分标准，评为0到6分，结果显示免疫评分与接受TKI治疗的转移性肾细胞癌患者的OS(P<0.001)和PFS(P=0.002)显著相关，是强有力的独立预后因素，可用来预测转移性肾细胞癌接受TKI治疗的疗效，可作为IMDC的补充来预测转移性肾细胞癌患者的生存期。

除可预测免疫治疗的疗效，有研究表明免疫评分系统还可预测接受新辅助放化疗的患者的应答情况。Huang等[30]选取了55例接受新辅助放化疗和手术治疗的局部晚期的结肠癌患者，通过免疫组化测量P53结合蛋白1(P53 binding protein 1，53BP1)的表达水平和计算CD3/CD8免疫评分，来评估新辅助放化疗的疗效。研究发现53BP1高表达组的患者比53BP1低表达组有更长的2年DFS(87.5%vs53.3%，P<0.05)，Cox多因素分析证实53BP1是DFS的独立预后因素，53BP1表达情况和免疫评分的高低与新辅助放化疗的治疗反应密切相关(P<0.05)。证实了53BP1表达水平与肿瘤微环境中T细胞浸润程度相关，53BP1的表达水平和CD3/CD8免疫评分可以有效预测新辅助放化疗的疗效。McLemore等[31]选取了76例浸润性乳腺癌患者进行化疗前活检，TILs>30%被认为是淋巴细胞丰富的患者，使用免疫组化评估PD-L1、CD68的水平，研究发现CD68+单核/巨噬细胞的数量和PD-L1的表达与浸润性乳腺癌的新辅助化疗明显相关，综合TILs、PD-L1和CD68这些免疫标记物可以更好的预测新辅助化疗的疗效。

通过近期的研究可发现，免疫评分系统在预测免疫治疗、新辅助放化疗的疗效方面有较好的效能，能够有希望作为生物标记物识别出可能有疗效的人群，从而可更好的指导临床治疗，更加符合现在倡导的个体化治疗、精准治疗的理念[32]。

4 免疫评分系统的优势以及当前面临的问题

免疫评分作为一项预后相关的生物标记物，主要的优势和特点如下：①免疫评分的过程操作简便，成本较低，周期短，自动化程度高，稳定性和可重复性高。检测的样品仅需两张包含CT和IM区域的肿瘤病理切片，仅需要染色CD3和CD8这两个抗体，检测技术是已经成熟的免疫组化技术，染色、扫描和数字病理分析都可以实现自动化，而且目前不同实验室的多项研究得到的结论是一致的。②免疫评分可以很好地预测以结肠癌为主的多种肿瘤的预后，包括复发时间、DFS和OS等指标。在结直肠癌中进行的大量研究证明免疫评分是一项可靠的预后指标，而其他肿瘤中进行的研究发现免疫评分系统的预后作用也是有效的。③免疫评分系统可以预测免疫治疗、新辅助放化疗的疗效。通过免疫评分对患者进行分层，识别出对治疗可能有疗效的人群，从而有针对性的进行治疗，或者对免疫评分低的患者化疗时额外使用抗体治疗，提高治疗的准确性。

虽然免疫评分系统在预测肿瘤患者的预后以及疗效方面有很大的优势，但是也面临着一些需要解决的问题：①免疫评分是一项定量检测，需要使用数字病理系统计算CD3+, CD8+TILs的密度，虽然数字病理系统已经展现出很高的效能，但是这一技术尚未被病理学界完全接受，计算结果与H&E染色光镜下观察的结果可能不完全一致[17]。②免疫评分的质量控制问题，评分系统需要更加完善的标准或者指南，以及严格的病理和实验操作，若偏离预定的标准化操作过程可能会导致免疫评分的量化不准确。③在实际临床中，有许多的样本是来自转移瘤的活检，IM区域并不能获取，这对评分效果造成影响。因此，活检免疫评分(a biopsy-adapted Immunoscore，ISB)被提出，研究发现尽管预后作用不如标准的免疫评分，但是活检免疫评分对患者仍然有良好的预后作用[33]。④对于不同地区、不同人种以及不同的肿瘤组织，免疫评分标记物的选择仍需要进一步完善，不排除会有新的标记物纳入，不同肿瘤的评分标准需要进一步的细化。⑤依据免疫评分结果调整患者的治疗方案仍然需要进一步的讨论和验证。例如III期的免疫评分高的结肠肿瘤患者是否可以接受减量化疗应进行验证[34]。

5 结语与展望

在传统的TNM分期基础上，将免疫评分作为癌症分期标准的一部分，即TNM-immune分期，将可进一步提升肿瘤预后评估，这将是第一个基于患者免疫情况的标准化的癌症分类方法。目前免疫评分在结直肠肿瘤的研究中表现出很好预后作用，进一步在更多的肿瘤中进行验证是有必要的。基于免疫评分的结果，可用来预测免疫治疗、新辅助放化疗的疗效，指导调整目前的治疗方案，改进个体化治疗策略，特别是活检的免疫评分可以指导调整新辅助治疗，从而可以提高临床治疗的准确性。

目前免疫评分已有标准化的操作流程，随着大量临床试验的进行，相信在不久的将来，免疫评分系统会得到越来越多的关注并且发挥越来越重要的作用，有希望作为TNM分期系统的补充部分进入肿瘤诊治指南，更好的指导临床实践。肿瘤患者通过免疫评分可以得知自身免疫系统的状况，从而接受到更加精准的、个性化的治疗，并最终获得更长的生存期。