CaMKⅡ翻译后修饰在心血管疾病中的作用研究进展

刘浙波，陶波，徐林，夏豪

(武汉大学人民医院心内科 武汉大学心血管病研究所 心血管病湖北省重点实验室，武汉430060)

心血管疾病是严重威胁人类健康的常见疾病，主要包括心力衰竭、心肌梗死、心律失常及心肌炎等，其中以心肌细胞结构及功能障碍为特征的心力衰竭是各类心血管疾病的终末阶段，而心肌细胞分子水平变化是引起心肌结构及功能障碍的主要原因[1-2]。蛋白激酶是将上游病理应激信号与下游调节程序联系起来的重要介质，其参与调控心脏重构中心肌细胞结构和功能的完整性。钙离子(Ca2+)-钙调蛋白依赖性蛋白激酶(Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase，CaMK)Ⅱ是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，其参与调控心脏结构重构、电重构等多种病理生理进程[3-4]。Koitabashi和Kass[1]研究指出，心力衰竭患者氧化型CaMKⅡ活性显著增加，氧化型CaMKⅡ通过促进心肌细胞凋亡、炎症介质释放及细胞内钙紊乱等方式影响心功能、诱导心律失常，导致心力衰竭患者心血管不良事件发生率显著升高。糖代谢异常患者则通过O-连接糖基化方式促进CaMKⅡ磷酸化，引起心肌细胞功能障碍，并增加恶性心律失常风险，且心肌梗死合并糖尿病患者心源性死亡风险显著升高[5]。随着研究的深入，CaMKⅡ在不同心血管疾病模型中的作用及与之相关的多种活化调控方式也逐渐成为研究热点，高特异性CaMKⅡ调控靶点治疗有望成为心血管疾病治疗的新策略。现就CaMKⅡ翻译后修饰(post-translational modification，PTMs)在心血管疾病中的作用予以综述。

1 CaMKⅡ的结构及功能

CaMKⅡ是一对六聚体环堆叠形成的全酶复合物，共12个单体，每个单体均包含N端催化区、中部调控区及C端连接区[6]。其包括α、β、γ和δ四种亚型，而心肌组织主要表达δ亚型。CaMKⅡδ又分为δB、δC亚型，δB亚型主要分布于胞质，参与电压门控离子通道及Ca2+动力学调控等兴奋收缩偶联过程，δC亚型包含核定位序列，主要参与兴奋转录偶联[7]。然而，两种剪接变体在其核质分布方面并不具备完全排他性，因两者存在于相同的十二聚体中，复合体中不同亚型的相对丰度将有利于细胞核或细胞质定位。研究证实，CaMKⅡ是将神经体液刺激与心脏重构关联的重要介质，心脏疾病早期即伴随CaMKⅡ活性升高，而晚期或终末期心力衰竭患者CaMKⅡ表达显著上调[1,8]。CaMKⅡ过度激活将诱发心肌细胞凋亡、炎症、延迟后除极、肌质网钙转运功能障碍等，并导致心脏收缩功能障碍、心律失常及心肌肥厚等心血管不良事件[9]。在心力衰竭初始阶段，CaMKⅡ可磷酸化兰尼碱受体(ryanodine receptors，RyRs)促进胞内钙紊乱、钙渗漏及钙火花频率增加[8]。虽然RyRs活化位点包含蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)依赖性S2808位点和CaMKⅡ依赖性S2814位点，而在RyRs-S2814位点敲除的小鼠模型中压力负荷引起的心肌细胞肥厚仍得到显著改善[10]，进一步证明了CaMKⅡ在心脏重构中的重要作用。另有证据显示，有效干预CaMKⅡ信号通路可改善心脏重构进展[11-12]，故特异性靶向CaMKⅡ有望成为心脏疾病或心力衰竭患者的有效治疗策略。

2 CaMKⅡ的活化与PTMs

CaMKⅡ激活可分为经典的Ca2+-钙调蛋白依赖性活化及非Ca2+-钙调蛋白依赖的自身磷酸化。经典的Ca2+-钙调蛋白依赖性活化是因胞内Ca2+与CaMK形成复合物并与CaMKⅡ C端连接区结合，解除了对N端催化区的抑制，进而活化CaMKⅡ；非Ca2+-钙调蛋白依赖的自身磷酸化是因内皮素1、去甲肾上腺素等激素或氧化应激条件通过调控区Thr287自身磷酸化及甲硫氨酸(Met281/282)氧化促进CaMKⅡ活化，主要机制可能包括：①氧化应激使磷酸酶失活增加，促进CaMKⅡ-Thr287自身磷酸化；②甲硫氨酸Met281/282氧化抑制了C端连接区对N端催化区的阻断作用[13]。两种方式的CaMKⅡ激活均在心血管疾病中发挥重要作用。

细胞内稳态取决于蛋白质合成、降解之间的动态平衡，包括蛋白质翻译、折叠、运输和蛋白质复合物形成；PTMs通过改变靶蛋白结构和功能来调节蛋白质的高效机制，PTMs可以刺激或抑制活性靶蛋白，从而显著影响下游信号转导[14]。PTMs的调节方式主要包括：①直接介导靶蛋白磷酸化、O-或N-连接糖基化、乙酰化等过程；②通过pH、离子浓度等化学介质间接调控；③裂解或降解靶蛋白，或与其他蛋白质相互作用构建信号转导复合物等[15]。CaMKⅡ作为蛋白激酶同样接受PTMs调控，主要包括氧化应激、亚硝基化、O-连接糖基化等方式。

2.1CaMKⅡ与氧化应激 氧化应激参与多种心血管疾病的发生、发展，这些应激反应将导致心肌细胞膜、蛋白质和DNA损伤，同时也会通过表达特定反应信号或直接调控其他信号转导途径进行适应性调节(即氧化还原信号转导)[16]。研究已证实，活性氧类会诱发PTMs对甲硫氨酸残基的动态调节[17]。体外研究表明，血管紧张素Ⅱ、内皮素1主要通过氧化应激活化CaMKⅡ，这一途径主要依赖于CaMKⅡ甲硫氨酸(Met281/282)位点氧化，在引发其自身磷酸化的同时抑制调控亚基与催化亚基结合，并成为氧化应激影响可兴奋细胞(如心肌细胞、神经细胞)的重要病理生理步骤[15]。不适当的血管紧张素Ⅱ慢性刺激在活化CaMKⅡ的同时，还可诱导心肌细胞p38促分裂原活化的蛋白激酶信号通路引发心肌细胞凋亡[18]，而血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡在表达CaMKⅡ氧化抗性突变体心肌细胞模型中被显著抑制[17]。循环系统中醛固酮水平升高也可促进CaMKⅡ甲硫氨酸位点氧化，加剧心脏病理性重构及心功能不全[19]。此外，氧化型CaMKⅡ还可调控L型钙通道、钠通道等，影响心肌细胞膜电位、钙稳态失调，增加心律失常的发生风险[3-4]。心力衰竭时氧化应激反应过度应答同时伴随线粒体活性氧类形成，这一过程促进了氧化型CaMKⅡ形成，并构成了心脏重构、心功能失调及心律失常的重要基础[20]。Luo等[21]研究发现，CaMKⅡ氧化抗性突变体(MM281/282VV)表型可显著减少心肌梗死合并糖尿病小鼠心肌细胞凋亡，改善心功能。

2.2CaMKⅡ与亚硝基化 一氧化氮合酶催化L-精氨酸产生一氧化氮(nitric oxide，NO)是S-亚硝基硫醇形成的重要步骤，天然形式的NO被进一步加工生成亚硝酸根离子或三氧化二氮后催化蛋白质半胱氨酸硫醇残基侧端形成S-亚硝基硫醇[22]。S-亚硝基化可能会促进或抑制目标蛋白质的活性，现已被证实的目标蛋白包括不同类型的离子通道、跨膜蛋白质以及各类转录因子[22]。体外心肌细胞实验表明，β肾上腺素能受体刺激可调控NO的产生，进而促进CaMKⅡ自身磷酸化，而给予L-NG-硝基精氨酸甲酯(NO合成抑制剂)可显著减少心脏舒张期钙火花频率；相反，添加NO供体亚硝基谷胱甘肽则增加了钙火花的速率，从而导致心律失常、心脏收缩功能障碍等，这可能与CaMKⅡ自身磷酸化引起的RyRs过度开放有关[23]。虽然S-亚硝基化诱导心肌细胞中CaMKⅡ活性的确切机制仍不清楚，但研究证实，C290是CaMKⅡ S-亚硝基化位点之一[23]。

2.3CaMKⅡ与O-连接糖基化 糖代谢异常是促进CaMKⅡ活化的重要原因，而O-连接糖基化在此过程中起重要作用。研究发现，O-连接糖基化可通过己糖胺生物合成途径增强CaMKⅡ活性，且O-连接糖基化诱导的CaMKⅡ自身磷酸化效应并不受细胞内Ca2+浓度影响[15]。同时，糖代谢异常诱导的CaMKⅡ活化增加了肌质网自发性火花频率，并导致心律失常和心肌细胞功能障碍，而特异性阻断O-连接糖基化或CaMKⅡ活性可减少糖代谢异常引起的CaMKⅡ信号通路过度激活[5]。此外，心肌梗死合并糖尿病小鼠模型的氧化应激及CaMKⅡ活性均增强，而CaMKⅡ抑制剂autocamtide-2相关抑制肽及间歇性有氧运动均有助于降低CaMKⅡ活性及致心律失常性钙渗漏，并改善心肌梗死后心脏功能[24]，其机制可能与糖代谢异常引起的高氧化应激或O-连接糖基化调控有关。O-连接糖基化与CaMKⅡ功能在代谢疾病中的机制目前尚未完全阐明，不同的修饰是否会导致CaMKⅡ在不同细胞器中的活化并调节对某些靶标的亲和力，未来值得深入探讨。

2.4CaMKⅡ与PKA信号通路 PKA由异聚体苏氨酸/丝氨酸激酶组成，包含2个调节亚基及催化亚基。调节亚基又分为PKARⅠ、PKARⅡ两种亚型，当两分子环腺苷酸与调节亚基结合时，PKA通过发生构象变化释放催化亚基，并促进底物磷酸化改变[25]。此外，调节亚基还含有N端二聚化对接结构域，N端二聚化对接结构域通过与A-激酶锚定蛋白结合实现PKA区域性、特异性信号转导[15]。研究已证实，PKA信号通路与CaMKⅡ密切相关[25]，且CaMKⅡ可以通过调控磷酸二酯酶4D影响基础和应激状态下 PKA活性[26]。Pereira等[27]研究指出，PKA和CaMKⅡ信号通路之间存在广泛的交互效应，且互为补充；同时他们还发现，β肾上腺素能受体刺激可活化交换蛋白Epac，引起CaMKⅡ依赖性RyRs磷酸化增加，从而导致心律失常性肌质网Ca2+释放；此外，Epac亚型还可通过促进PKA依赖性RyRs S2808位点磷酸化，调控肌质网Ca2+释放。PKA和CaMKⅡ信号通路对心脏基因组调控及表达同样具有重要作用，如对组蛋白去乙酰化酶家族成员组蛋白脱乙酰酶(histone deacetylase,HDAC)5的表达调控，β肾上腺素能受体刺激和(或)CaMKⅡ活化均可促进HDAC5核转位，相较于CaMKⅡ/蛋白激酶D信号通路，PKA信号通路在应激状态下的作用更为显著[28]。

2.5其他PTMs方式 β-抑制蛋白是另一组可与CaMKⅡ相互作用的蛋白质[29]。在与G蛋白偶联受体结合后，β-抑制蛋白作为衔接分子参与调控多种心血管疾病相关靶蛋白，如环腺苷酸、磷酸二酯酶、胞外信号调节激酶1/2及CaMK Ⅱ δ等[30-31]。Noma等[32]在心力衰竭模型中发现，激动β1肾上腺素能受体及血管紧张素Ⅱ1A型受体可促进β-抑制蛋白介导的胞外信号调节激酶活化，发挥心脏保护作用。然而，β-抑制蛋白介导的CaMKⅡδ活化会使心血管不良事件增加[33]。β-抑制蛋白对心脏稳态的这种选择性作用，使得未来的研究方向将侧重于“偏向配体”的研究，“偏向配体”研究将有助于消除因选择性活化带来的心血管不良事件。

钙蛋白酶可有效降解细胞损伤时释放的膜相关底物。体外原代神经细胞培养观察到，钙蛋白酶介导的核CaMKⅣ水解可直接影响CaMK依赖性基因转录，从而防止过度的核转录反应[34]。目前尚无研究证实蛋白水解对心脏CaMKⅡ活性的介导作用，但仍有大量未知的CaMKⅡ调控机制未被发掘。虽然长期以来CaMKⅣ被认为仅表达于神经组织，但已有研究证实，这种特殊的CaMK亚型对于控制内皮细胞中的一氧化氮合酶活性具有重要作用[35]，这一发现揭示了更深层次的CaMK依赖性血压调控机制。Framingham100K心脏研究项目中进行的全因组分析指出，血管壁僵硬度与人类CaMKⅣ基因变体之间有重要联系[36]，这为其他CaMK家庭成员在心血管健康和疾病进展中的作用开辟了新研究方向。

3 CaMKⅡ与心血管疾病

3.1CaMKⅡ与急性冠状动脉综合征及缺血再灌注损伤 急性冠状动脉综合征主要包括不稳定型心绞痛、急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)等。AMI具有较高的发病率、病死率，早期开通病变血管是治疗AMI的有效手段。然而，因心肌缺血再灌注带来的心肌损伤会使AMI患者不良心血管事件发生率显著增加。AMI及缺血再灌注损伤的主要机制包括细胞凋亡、坏死及过度炎症反应。细胞凋亡或程序性细胞死亡是器官有序发育的重要生理机制，但同时也会引起细胞过度损耗影响心肌收缩而成为心肌重构重要的病理生理学标志。CaMKⅡ的促凋亡作用最早被发现于非心源性肿瘤细胞中[37]，随后基于β肾上腺素能受体过度活化的心源性CaMKⅡ促凋亡途径被不断证实。不同亚型CaMKⅡ在心肌细胞凋亡中发挥着不同作用，Peng等[38]研究发现，仅CaMKⅡδC具有促凋亡作用，而CaMKⅡδB发挥抗凋亡作用。Ling等[39]通过对小鼠心肌缺血再灌注模型进行研究发现，CaMKⅡδC敲除可显著抑制再灌注诱导的心肌细胞凋亡，改善心肌功能。与凋亡不同，坏死往往被认为是由缺氧、炎症等触发的非ATP依赖性细胞死亡过程，这种坏死性调节又被称为坏死性凋亡，是细胞调控的重要组成部分。缺血再灌注损伤可通过促进CaMKⅡ或受体相互作用蛋白3活化等方式促进坏死性凋亡，有效阻断CaMKⅡ激活则显著抑制坏死性凋亡[37]。

既往研究指出，CaMKⅡ主要通过增加细胞内钙超载、线粒体内膜钙单项转运体电流等过程影响线粒体通透性转换孔，并最终导致内膜去极化及细胞死亡[40]。因此，通过调节CaMKⅡ活性有望改善心脏重构中的凋亡进展。研究显示，CaMKⅡ可激活T细胞，并在T细胞记忆功能中发挥重要作用；且CaMKⅡ还可调控免疫系统巨噬细胞相关炎症因子释放及树突功能[41-42]。同时，炎症信号可通过Toll样受体活化、白细胞介素-10释放等反馈式激活CaMKⅡ形成协同作用[41]。心血管中的CaMKⅡ信号通路功能多样，并可参与心肌缺血、再灌注损伤等多种病理生理过程，影响炎症反应、心脏功能等。研究指出，在急性炎症反应(如缺血再灌注损伤)中，活化的CaMKⅡ主要通过解除IκB激酶对核因子κB的抑制作用促进炎症反应[35]。心肌梗死慢性病程中涉及不同阶段炎症反应及炎症细胞类型，CaMKⅡ则通过参与炎症趋化物释放、单核细胞募集等方式促进心脏慢性炎症发展[41]。此外，CaMKⅡ在血管相关炎症反应中也具有重要作用，Westra等[43]研究发现，抑制CaMKⅡ活性将导致巨噬细胞缺氧诱导因子-1α表达水平下降，同时下调血管内皮生长因子表达，抑制血管生成。Banumathi等[44]同样指出，视网膜血管生成高度依赖于CaMKⅡ，CaMKⅡ抑制剂KN-93可显著抑制视网膜血管生成。因此，通过抑制CaMKⅡ活性治疗心肌梗死时，可能因CaMKⅡ依赖性血管生成障碍而加重局部心肌组织缺血缺氧，影响预后。

3.2CaMKII与心力衰竭 心力衰竭是心肌肥厚、心肌梗死及心肌炎等心脏疾病的终末阶段。CaMKⅡ可通过细胞内钙紊乱、线粒体功能障碍、心肌纤维化及炎症等多种机制促进心力衰竭的发生、发展。细胞内钙紊乱、肌质网钙容量下降是心功能障碍的重要原因，Westenbrink等[45]研究发现，CaMKⅡδ转基因小鼠肌质网钙容量显著下降，而受磷蛋白敲除则显著逆转CaMKⅡδ引发的钙渗漏，并改善肌质网Ca2+重摄取及心脏功能。此外，RyR2-S2814位点敲除小鼠可引发心肌舒缩障碍，而CaMKⅡ沉默逆转了这一现象[10]。因此，由CaMKⅡ介导的钙循环紊乱是心功能障碍的重要原因。

CaMKⅡ还可通过兴奋转录偶联调控HDAC4、HDAC5，促进心肌纤维化及心脏重构，研究表明，CaMKⅡ介导的HDAC4、HDAC5信号通路主要通过促进肌细胞增强因子2及下游基质金属蛋白酶9转录增加，发挥促纤维化作用[46]。线粒体功能障碍是心功能不全的诱因，研究证实，CaMKⅡ可通过调控解偶联蛋白3影响线粒体功能，有效抑制CaMKⅡ活性可改善线粒体功能障碍引起的心功能异常[45]。心肌细胞凋亡也是心力衰竭的重要特征，有效抑制CaMKⅡ活性有望阻断凋亡、纤维化、细胞内钙紊乱等多种心力衰竭诱因。

3.3CaMKⅡ与心律失常 早后除极和延迟后除极是心律失常的使动因素，早后除极发生在动作电位复极2～3期，延迟后除极则发生在4期，当除极电位达到膜电位阈值时则诱发心律失常[47]。因各种病理性因素(炎症、组织损伤、氧化应激等)诱导的CaMKⅡ活化将介导RyR2-S2814过度磷酸化，并显著促进肌质网钙释放引发钙渗漏[1]。生理状态下，肌质网钙泵可将Ca2+转运至肌质网，而病理状态下的钙渗漏将触发致心律失常性钠钙交换电流，引发延迟后除极和心律失常；此外，CaMKⅡ还可通过促进Nav1.5磷酸化增加晚钠电流，晚钠电流将引发心肌细胞胞质钠超载及继发性钙超载，而胞质内钠钙离子紊乱构成了延迟后除极的基础[48]。CaMKⅡ可增强内向钠电流及L型钙电流，并弱化外向钾电流，这一过程将使膜电位复极时间显著延长，此时，因内向电流(如早钠电流)已从失活中恢复，故未完全复极的膜电位可再次激活相关离子通道，诱发早后除极引发心律失常[49]。

3.4CaMKⅡ与恰加斯心肌病 恰加斯心肌病是一种病死率较高的感染性疾病，目前缺乏有效治疗手段，特别是对处于慢性病程阶段的患者。有研究发现，CaMKⅡ信号通路可通过促进克氏锥虫血红素诱导性细胞增殖影响恰加斯心肌病进展，且恰加斯心肌病可不同程度通过CaMKⅡ信号通路影响心肌细胞内钙转运[50]。有学者在布氏锥虫相关心肌病中发现了类似现象，布氏锥虫可直接激活CaMKⅡ引起心律失常及肌质网钙渗漏；另外，CaMKⅡ还介导了布氏锥虫相关心肌病中CC趋化因子配体2和CC趋化因子配体3的释放，影响心肌功能[51]。因此，CaMKⅡ在恰加斯相关心肌病中的作用有待更多研究证实。

4 小 结

心肌细胞分子水平变化是对病理性应激源的持续反应，其特征在于心肌肌细胞肥大、凋亡、炎症、离子电流改变及收缩功能受损并最终导致心力衰竭。病理性心脏重构过程中均伴随着不同程度的分子变化、蛋白激酶表达、酶活性和(或)亚细胞定位改变等不良适应性信号转导。CaMKⅡ属于蛋白激酶家族成员，作为重要的调节分子，其可识别不同类型的应激源，并调控心脏病理生理下游信号途径，在心脏结构重构及电重构中发挥重要作用。有效抑制CaMKⅡ活性将有助于改善心血管疾病患者预后及恶性心律失常风险。深刻理解CaMKⅡ在不同状态下的调节机制同样有助于特异性CaMKⅡ靶点治疗研发，在兼备高治疗效果的同时也避免了潜在的脱靶效应。