NLRP3炎症小体在心血管疾病中作用的研究进展

殷均奎，赵庆彦

(武汉大学人民医院心内科 武汉大学心血管病研究所 心血管病湖北省重点实验室，武汉 430060)

自2002年Martinon等[1]首次报道炎症小体以来，炎症小体在固有免疫中的作用开始引起学者们的关注。2006年，Martinon等[2]研究发现核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体可以被尿酸盐结晶激活并参与痛风的病理生理过程，此后NLRP3炎症小体与无菌性炎症反应性疾病的关系开始受到学者们的重视。近年来研究发现炎症反应在心血管疾病的发生、发展、转归中发挥关键作用[3]，而NLRP3炎症小体作为目前结构和功能最为明确的炎症小体在心血管疾病中的作用受到广泛关注。心血管系统的各种组织细胞损伤和病原侵入均可激活NLRP3炎症小体[4-6]，活化的NLRP3炎症小体进一步激活胱天蛋白酶(caspase)-1并可介导白细胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-18等炎症因子的产生及细胞焦亡，从而参与多种心血管疾病的病理生理过程。现就NLRP3炎症小体在高血压、动脉粥样硬化、心肌梗死、心律失常中的作用进行综述，以期为心血管疾病的临床诊治提供新思路。

1 NLRP3炎症小体概述

1.1NLRP3炎症小体与固有免疫 NLRP3炎症小体是由感受器蛋白NLRP3、起衔接作用的含CARD结构域的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)以及效应器蛋白Pro-caspase-1三部分组成的多蛋白复合体[7]。NLRP3蛋白包含三个区域[7-9]，包括C端的富亮氨酸区域、中央的核苷酸酶激活和寡聚区域(NACHT区域)及N端的热蛋白结构域；ASC蛋白由两部分组成，包括N端的热蛋白结构域和C端的CARD；Pro-caspase-1蛋白包含N端的CARD和C端的催化结构域。固有免疫主要通过固有免疫细胞的模式识别受体识别病原微生物或其产生的病原相关分子模式及受损组织细胞产生的损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)，并在清除病原微生物和受损的组织细胞过程中释放出大量的炎症因子。模式识别受体按亚细胞定位分为两大类，包括跨膜的Toll样受体和C型凝集素受体(C-type lectin receptors,CLRs)及位于胞质内的视黄酸诱导基因-I样受体和NOD样受体[10]。但近年来研究发现，心血管系统的组织细胞也可以表达多种模式识别受体，如Toll样受体几乎表达于心血管系统的所有细胞[11]，CLRs可表达于平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞和血小板[12]。NLRP3炎症小体作为NOD样受体蛋白家族的重要成员，除主要表达于单核/巨噬细胞外，也广泛表达于心血管系统的内皮细胞[13]、平滑肌细胞[14]以及树突状细胞、T细胞[15-16]，甚至心肌成纤维细胞[17]和心肌细胞[18]，可以识别多种内源性和外源性的病原相关分子模式和DAMPs，这为NLRP3炎症小体参与多种心血管疾病提供了分子细胞学基础。

1.2NLRP3炎症小体的活化及效应 NLRP3炎症小体活化的经典机制主要包括两个步骤：第一步为炎症小体活化的启动阶段[19-21]，主要是病原相关分子模式和DAMPs以及IL-1β和肿瘤坏死因子-α等细胞因子作用于巨噬细胞等细胞表面的Toll样受体和细胞因子受体，激活细胞内的核因子κB信号通路，诱导NLRP3蛋白及Pro-IL-1β和Pro-IL-18表达上调；第二步为炎症小体的活化组装阶段[9]，各种DAMPs作用于NLRP3蛋白的C端的富亮氨酸区域，引起NLRP3蛋白中央的核苷酸酶激活和寡聚区域的寡聚，形成一个以寡聚区域为核心的分子平台，而NLRP3蛋白N端的热蛋白结构域通过同型相互作用与ASC蛋白的热蛋白结构域连接，ASC蛋白C端的CARD再通过同型相互作用与Pro-caspase-1的CARD连接从而完成NLRP3炎症小体的组装。相邻的Pro-caspase-1可以形成二聚体，在炎症小体组装完成后，二聚体的Pro-caspase-1暴露出酶切位点进行自我剪切，产生两个CARD及两个p20亚基和p10亚基，两个p20亚基和p10亚基结合成异质四聚体，从而形成具有全酶活性的caspase-1[22]。caspase-1可以将Pro-IL-1β和Pro-IL-18剪切为成熟的IL-1β和IL-18，参与各种炎症反应[23]；此外caspase-1可以介导消皮素D的蛋白酶切，产生一个C端区域和N端区域，N端区域具有亲脂性可结合在细胞膜上形成直径10～14 nm的微孔，引起细胞内外渗透压的改变，最终导致细胞肿胀和破裂死亡，即细胞焦亡[24]。各种DAMPs如胞外ATP、胆固醇晶体、尿酸一钠结晶、二氧化硅晶体、石棉、铝盐等引起NLRP3炎症小体活化组装的机制目前尚未完全阐明，研究认为各种DAMPs通过共同的上游机制包括K+外流[25]、线粒体活性氧类产生[26]、溶酶体组织蛋白酶释放[27]等引起NLRP3炎症小体活化组装，但具体机制有待进一步研究。

2 NLRP3炎症小体与心血管疾病

2.1NLRP3炎症小体与高血压 人体血压的调节包括神经调节(中枢神经系统和自主神经系统的双向调控)和体液调节(主要为肾素-血管紧张素-醛固酮系统)，而NLRP3炎症小体在高血压的神经体液调节过程中发挥重要作用。Avolio等[28]比较了自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)(表现为自发的高血压倾向)和维斯塔京都种大鼠(对照)脑部血压调控区域的NLRP3炎症小体组分的表达情况，发现SHR大鼠的杏仁核、下丘脑和脑干等心血管调节中枢caspase-1、NLRP3和IL-1β的信使RNA表达水平明显升高。Qi等[29]研究了下丘脑室旁核IL-1β表达增加在盐敏感高血压发展过程中的促交感兴奋作用，发现高盐饮食大鼠室旁核IL-1β的表达较正常盐饮食大鼠明显增加，同时高盐饮食大鼠的平均动脉压、心率和血清去甲肾上腺素水平较正常盐饮食大鼠明显升高，而当室旁核注射Gevokizumab(IL-1β抑制剂)后大鼠的平均动脉压、心率和血清去甲肾上腺素均明显降低。Qi等[30]进一步研究了抑制大鼠室旁核NLRP3炎症小体活化信号通路中的核因子κB蛋白对盐敏感高血压大鼠交感激活的影响，发现核因子κB抑制剂使盐敏感高血压大鼠平均动脉压和去甲肾上腺素均明显降低，这一效应与核因子κB抑制剂降低大鼠室旁核NLRP3炎症小体和IL-1β的表达水平有关。上述系列研究表明，高血压状态下心血管中枢存在NLRP3炎症小体的过度激活，而干预心血管中枢NLRP3炎症小体的激活可通过降低交感神经活动缓解高血压状态。血管重构是高血压发病的一个重要机制，长期高血压又可引起血管的重构，从而形成恶性循环，而主动脉血管重构引起的血管硬化是老年人高血压的主要致病原因[31]。

Sun等[32]研究了NLRP3炎症小体在高血压状态下对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)表型转化和增殖的影响，发现SHR大鼠主动脉中层和VSMCs的NLRP3炎症小体组分、IL-1β表达水平均较维斯塔京都种大鼠明显上调，同时SHR大鼠主动脉中层的收缩蛋白组分表达下调，而基质蛋白组分表达上调，表明SHR大鼠的主动脉中层存在VSMCs表型由收缩型向合成型的转化；而敲除或使NLRP3基因表达沉默，则可抑制这一转化作用，同时也观察到敲除NLRP3基因时SHR大鼠VSMCs的增殖能力降低，而使SHR大鼠NLRP3基因表达沉默时观察到平均动脉压、主动脉中膜厚度及主动脉中膜厚度与主动脉管腔直径比值降低。在Sun等[32]研究的基础上，Ren等[33]进一步研究了NLRP3炎症小体在血管紧张素Ⅱ诱导的高血压大鼠模型的VSMCs表型转化和血管重构中的作用，发现血管紧张素Ⅱ能引起野生型大鼠VSMCs的NLRP3炎症小体组分和IL-1β表达明显增加，同时能促进野生型大鼠VSMCs的增殖和表型由收缩型向合成型的转化，并增加野生型大鼠主动脉中膜厚度，而敲除NLRP3基因能抑制VSMCs中NLRP3炎症小体组分的表达，同时降低血管紧张素Ⅱ引起的血压升高和VSMCs表型转化及主动脉中膜厚度的增加。以上研究表明，NLRP3炎症小体参与高血压状态下主动脉血管的重构，尤其是在肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活所致的血管重构中发挥重要作用。

2.2NLRP3炎症小体与动脉粥样硬化 动脉粥样硬化引起的血管狭窄对器官的血流供应和功能可产生明显影响，而动脉粥样硬化不稳定斑块脱落引起局部心脑组织血流中断更是心脑血管疾病致死、致残的主要原因。作为NLRP3炎症小体激活后的下游效应分子，IL-1β在动脉粥样硬化中的作用早已得到相关研究的证实。Kirii等[34]通过制备载脂蛋白E-/-/IL-1β-/-和载脂蛋白E-/-/IL-1β+/+小鼠模型并予以正常的胆固醇和脂肪饮食，发现相较于载脂蛋白E-/-/IL-1β+/+小鼠，载脂蛋白E-/-/IL-1β-/-小鼠的主动脉窦粥样斑块面积可减少约30%，而这一效应可能与IL-1β缺乏抑制单核细胞向脂质沉积部位迁移有关。为进一步明确NLRP3炎症小体在动脉粥样硬化中的作用，Duewell等[35]制备了低密度脂蛋白受体基因敲除的骨髓嵌合体小鼠模型(骨髓细胞基因型为NLRP3-/-,ASC-/-,或IL-1α/β-/-)，观察炎症小体蛋白组分缺乏对小鼠动脉粥样硬化进展的影响，发现骨髓嵌合体小鼠的动脉粥样硬化进展明显延缓。Zheng等[36]则研究了NLRP3蛋白的表达量与冠状动脉狭窄程度的关系，通过比较行冠状动脉旁路移植手术患者的升主动脉与无动脉粥样硬化的肾捐赠者肾动脉的NLRP3蛋白表达情况，发现前者的NLRP3蛋白表达明显高于后者，且NLRP3蛋白的表达量与冠状动脉狭窄程度呈正相关。Shi等[37]比较了颈动脉粥样硬化斑块部位和正常的肠系膜动脉的NLRP3/IL-1β信号通路组分的表达，发现颈动脉粥样斑块部位的NLRP3/IL-1β信号通路组分大量表达，而正常的肠系膜动脉未见明显表达；他们同时比较了颈动脉不稳定粥样硬化斑块和稳定性粥样硬化斑块的NLRP3/IL-1β信号通路组分的表达，发现前者的表达明显高于后者；此外分析颈动脉粥样硬化斑块形成患者与无颈动脉狭窄患者的血浆IL-1β和IL-18表达水平，发现前者血浆目标炎症因子水平明显高于后者，该研究首次揭示了NLRP3/IL-1β信号通路与人颈动脉粥样硬化斑块形成的关系。综上所述，NLRP3/IL-1β在动脉粥样硬化的病情进展中发挥重要作用，靶向NLRP3/IL-1β信号通路可能为抑制动脉粥样硬化进展和稳定动脉粥样硬化斑块提供新思路。

2.3NLRP3炎症小体与心肌梗死 冠状动脉粥样硬化不稳定斑块破裂引起的冠状动脉血栓形成和病变冠状动脉持续的血流中断是急性心肌梗死的主要病因，而缺血坏死心肌可释放出大量的ATP和氧化应激产物(活性氧类)，这些均是NLRP3炎症小体的活化刺激因子。Kawaguchi等[38]检测了心肌梗死患者的心肌组织，发现心肌梗死部位主要的炎症细胞浸润为巨噬细胞和中性粒细胞，且这些细胞中ASC的表达水平明显升高。作为炎症小体的共有组分，ASC表达水平升高提示固有免疫细胞中的炎症小体参与心肌梗死后的心肌组织的病理变化过程[9]。为了进一步明确心肌固有细胞中炎症小体的表达及作用，Kawaguchi等[38]用脂多糖处理离体培养的新生小鼠的心肌细胞和心肌成纤维细胞，发现脂多糖可明显诱导心肌成纤维细胞产生IL-1β，且脂多糖诱导ASC-/-小鼠心肌成纤维细胞产生的IL-1β明显少于野生型小鼠，而脂多糖对心肌细胞无诱导IL-1β产生的作用；Mezzaroma等[18]通过离体培养成年小鼠心肌细胞，研究了脂多糖和ATP双重刺激下小鼠心肌细胞NLRP3炎症小体的表达情况，发现单独的脂多糖或ATP刺激无法诱导NLRP3炎症小体的形成，而双重刺激信号可引起小鼠心肌细胞死亡明显增加，且心肌细胞死亡与caspase-1的表达水平呈正相关，而caspase-1抑制剂可抑制这一现象。这些离体细胞实验表明,在一定的条件下心肌细胞和心肌成纤维细胞均可以表达炎症小体，而炎症小体的表达可以促进炎症反应和心肌细胞的死亡。 Sandanger等[17]通过结扎小鼠冠状动脉观察了心肌梗死后小鼠心室肌NLRP3、IL-1β及IL-18 信使RNA的表达，发现相较于假手术组，研究组NLRP3、IL-1β及IL-18 信使RNA表达水平明显升高，且升高主要出现在心肌成纤维细胞；他们进一步利用NLRP3基因敲除小鼠制备了缺血再灌注模型，发现相较于野生型小鼠，基因敲除小鼠的心功能明显改善且缺血性损害明显减轻，从而直接证明了NLRP3炎症小体尤其是心肌成纤维细胞中NLRP3炎症小体表达在心肌梗死及缺血再灌注中的作用。此外，有学者通过小鼠缺血再灌注模型实验发现，NLRP3炎症小体在心肌的表达具有时间依赖性，在心肌梗死后的3 h内，心肌梗死部位的NLRP3炎症小体表达水平较低，而在梗死后3～24 h，NLRP3炎症小体表达水平逐渐升高；同时他们发现，缺血再灌注后立即腹腔内给予以NLRP3抑制剂并不能减小3 h后的梗死面积，但可明显减少24 h后的心肌梗死；而当再灌注后延迟1 h给予NLRP3抑制剂可使24 h后 caspase-1活性降低和心肌梗死面积明显减小；但延迟3 h给药不能观察到这一现象[39-40]。这些在体实验研究均表明，NLRP3炎症小体在急性心肌梗死及缺血再灌注损伤中扮演重要角色，虽然急性心肌梗死及缺血再灌注情况下NLRP3炎症小体被激活的机制仍不完全清楚，但干预NLRP3炎症小体的活化过程可能为改善心肌缺血再灌注损伤后的心功能提供有益的临床借鉴。

2.4NLRP3炎症小体与心律失常 心房颤动作为最常见的持续性心律失常，其发生机制复杂，而心房肌的电重构和结构重构为其发生和维持的两大病理学基础[41]。Yao等[42]从心房颤动患者的心房组织中分离出心房肌细胞并检测了caspase-1的p20亚基的表达情况，发现相较于无心房颤动病史的患者，阵发性心房颤动和持续性心房颤动患者心房肌细胞的p20亚基表达均明显增加。他们进一步利用基因敲入技术使小鼠的心房肌细胞特异性表达NLRP3炎症小体，发现相较于野生型小鼠，基因敲入小鼠的p20亚基和IL-1β表达均增加，同时心电图记录的房性期前收缩事件和重复起搏诱导的心房颤动发生也明显增多，而腹腔内注射NLRP3炎症小体抑制剂MCC950可抑制心房颤动诱发；Yao等[42]还研究了NLRP3炎症小体表达对心房电重构和结构重构的影响，发现基因敲入小鼠的心房异位电活动、异常的肌质网Ca2+释放均增多，而心房的有效不应期缩短，同时基因敲入小鼠的心房更大，心肌纤维化标志物的信使RNA表达水平更高，表明基因敲入小鼠的心肌成纤维细胞活动增加；而使用腺病毒亚群9基因转染特异性的敲除基因敲入小鼠的NLRP3炎症小体基因时，基因敲入小鼠心肌细胞的Ryr2、Kcna5、Girk1、Girk4等介导心房电重构的离子通道蛋白亚基的信使RNA表达水平又趋于正常，且基因敲入小鼠的心房颤动诱发也明显减少，证明心房肌NLRP3炎症小体表达增加在心房肌电重构、结构重构及心房颤动诱发中的重要作用，同时也为心房颤动的治疗提供了新思路。心肌梗死后交感神经过度激活可导致恶性室性心律失常的发生，而下丘脑的室旁核具有心血管调节功能[43]，研究表明室旁核的炎症反应与心血管交感紧张的调节相关[44]。Wang等[45]研究表明，心肌梗死后24 h室旁核的小神经胶质细胞的CLRs及其内源性配体剪接体相关蛋白130和NLRP3及IL-1β表达明显增加，同时伴随着交感神经的过度激活。他们进一步研究了CLRs激活与心肌梗死后交感神经过度激活的关系及NLRP3炎症小体在其中的作用，发现当向小鼠的室旁核显微注射脂多糖和重组剪接体相关蛋白130时，小鼠室旁核的CLRs和IL-1β表达较单独注射脂多糖明显增加，且交感神经活动和外周血去甲肾上腺素水平明显升高，而使用干扰小RNA干扰室旁核的NLRP3表达或室旁核显微注射IL-1β拮抗剂后，交感活性和外周血去甲肾上腺素水平升高可被抑制，相应的电刺激诱导室性心律失常评分也降低，从而验证了NLRP3炎症小体在小鼠心肌梗死后室旁核CLRs激活介导的交感活性增强致室性心律失常中的重要作用。

3 小 结

NLRP3炎症小体作为广泛存在于心血管系统组织细胞中的一种信号转导蛋白复合体，可识别胆固醇晶体、受损细胞产生的ATP和活性氧类等DAMPs及侵入机体的细菌崩解代谢产物如脂多糖和病毒的RNA等病原相关分子模式，介导促炎细胞因子IL-1β和IL-18的产生和细胞的炎性死亡——细胞焦亡。其除在高血压、动脉粥样硬化、心肌梗死及心律失常的病程进展中发挥重要作用外，还在糖尿病心肌病[46]、病毒性心肌炎[47]等心血管疾病的病情演变中扮演重要角色。目前靶向NLRP3炎症小体信号通路在心血管疾病中的临床研究已取得一定进展，如在一项大规模的随机、双盲、安慰剂对照临床研究中，IL-1β的单克隆抗体卡那单抗已被证明可使既往有心肌梗死病史患者的主要心血管终点事件(心肌梗死、脑卒中)再发生率降低15%[48]，这显示了靶向NLRP3炎症小体信号通路在临床上良好的应用前景。虽然在基础研究中靶向NLRP3炎症小体信号通路的其他组分如P2X7蛋白(介导K+外流的ATP敏感K+通道)、激活启动阶段的核因子κB蛋白、NLRP3蛋白及caspase-1显示出了较好的心血管保护作用，但相关的临床研究尚缺乏，而这可能是未来学者们的研究重点。