斑马鱼白血病模型的研究进展

向文碧，何志旭，舒莉萍

(1.贵州医科大学细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室 组织工程与干细胞实验中心，贵阳 550004； 2.中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室，贵阳 550004； 3.贵州医科大学儿科学教研室，贵阳 550004； 4.遵义医科大学附属医院儿科学教研室，贵州 遵义 563004)

白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病，通常来源于骨髓。 2015年，有超过230万患白血病的患者，全球超过350 000人死于白血病[1]。在美国，2017年有62 130例新发白血病病例，白血病导致24 500例死亡，白血病患者的5年生存率约为63%[2]。虽然大多数白血病累及成人，但白血病也是儿童癌症中最常见的诊断。白血病主要按两个标准分类，按起源细胞分类：淋巴起源的白血病被称为“淋巴细胞性或淋巴细胞系白血病”，而骨髓来源的白血病被称为“骨髓性或髓系白血病”；根据生长速度分为急性白血病和慢性白血病。白血病的发病原因多种多样，一些与染色体异常直接相关(如慢性髓系白血病中的费城染色体)，一些白血病涉及血细胞生长、分化和存活相关的多个基因的突变和(或)易位。然而，大多数白血病的病因不明，尚有一些患者无染色体异常且无已知的基因突变，突出了需要在动物模型中进一步研究以揭示这些未知的造血系统恶性肿瘤的驱动因素。现就斑马鱼白血病模型的最新研究进展予以综述。

1 斑马鱼模式生物的生物学优势

斑马鱼是一种淡水硬骨鱼，自20世纪70年代有学者首次使用斑马鱼作为模型生物[3]以来，越来越多的实验室开始使用这种强大的生物来研究发育和疾病，因为它具有许多优于其他模式生物的优势。首先，斑马鱼体外受精，胚胎通体透明，易于观察和进行实验操作；另外，斑马鱼发育迅速，大多数主要器官在受精后2～3 d形成，3个月左右达到性成熟，一次繁殖可产生数百枚胚胎[4]，使得斑马鱼成为用于大规模筛查的理想模型。

斑马鱼在血液系统关键发育过程的高度保守使人们能够识别出与人类造血功能障碍有关的几个基因[5]。此外，由于白血病细胞的特殊性，使用荧光蛋白标记可视化转基因斑马鱼体内的白血病发生过程，将有助于进行白血病的研究。与小鼠的给药方式相比，斑马鱼可以直接从水中摄入小分子化合物，方便快捷，易于对药物进行高通量筛选。通过转基因斑马鱼筛选程序鉴定小分子将有助于开发用于治疗疾病(特别是癌症)的新型药物。因此，转基因斑马鱼在造血、造血系统疾病和白血病的研究方面具有很好的前景。

在患有免疫功能低下的小鼠中进行异种移植是一种具有代表性的体内研究方法，用于研究恶性血细胞生成的生物学以及开发针对血液疾病的新疗法[6-7]。然而，由于小鼠实验的局限性(包括实验程序的时间安排和动物房的设施成本)，小鼠模型不适合用于对潜在候选药物进行快速、经济有效的筛查；此外，免疫抑制可以改变造血微环境，从而影响肿瘤细胞的行为和对治疗的反应[8]。与其他脊椎动物模型系统相比，用斑马鱼胚胎进行异种移植可提供许多优点：斑马鱼在受精后4周缺乏成熟的适应性免疫系统，允许移植且不需要免疫抑制[9]；斑马鱼是光学透明的，并且与注射的细胞一样，可以用各种荧光染料特异性标记，达到体内细胞-细胞相互作用的可视化；斑马鱼繁殖迅速且价格低廉，允许进行高通量药物筛查[10]。目前，通过斑马鱼药筛体系筛选出的药物已进入临床试验[11]。

2 斑马鱼的正常造血过程

斑马鱼造血发育主要有原始造血和定向造血两个阶段[12]。原始造血在受精后24 h从两个位置产生，前侧板中胚层产生骨髓谱系，中间细胞团产生原始骨髓和红细胞，然后，原始骨髓细胞在卵黄囊周围迁移并分化成不同的骨髓谱系[13]。定向造血能够产生和重建整个造血系统的造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，从受精后26 h开始，定向HSCs从主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros，AGM)区域背主动脉的血源性内皮细胞中出现，然后HSCs在受精后48 h迁移至尾部造血组织，这是后血岛的扩张，并且作为瞬时造血部位产生红细胞、骨髓细胞和血小板，来自AGM区域的HSCs约在受精后48 h定殖于肾髓[14]。斑马鱼肾髓与哺乳动物骨髓相似，可产生所有的成熟血液细胞谱系，包括胚胎和成年斑马鱼的红系、髓系和淋系[15]。在大约受精后54 h时，来自AGM区域的淋巴样祖细胞转移到胸腺，即淋巴T细胞成熟的位置，尽管造血部位存在差异，但斑马鱼的每个造血过程与哺乳动物一样都是非常保守的[15-16]。

3 斑马鱼白血病模型的研究进展

斑马鱼和人类造血发育高度保守[17]，利于造血系统恶性肿瘤斑马鱼模型的发展，有助于阐明恶性肿瘤的分子发病机制，并加快新疗法的临床前研究[18]。

3.1淋系白血病的斑马鱼模型 第一个急性T淋巴细胞白血病(acute T-lymphocytic leukemia，T-ALL)转基因斑马鱼模型是由Langenau等[19]通过将小鼠c-Myc基因与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因融合，以淋巴细胞特异性启动子rag2驱动EGFP-mMyc融合基因的表达而构建的。该模型首次在荧光显微镜下监测EGFP标记的白血病细胞的发生过程。然而，由于该转基因鱼(30日龄)中白血病发病非常迅速，因此，很难长期观察和研究白血病的发生、发展。为了克服这个问题，该组构建了一个条件转基因斑马鱼系，在EGFP-mMyc致癌基因前面加一个loxed dsRED2基因，通过Cre介导的LoxP-dsRED2-loxP重组盒控制c-Myc的表达[20]。该鱼未注射Cre信使RNA重组酶时，表达红色荧光，不会发生白血病。通过将Cre信使RNA注入单细胞期胚胎，可以诱导转基因后代发生T-ALL。

Myc致癌转录因子在大多数T-ALL病例中过表达，人第10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)/磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)通路中的基因突变在T-ALL中也是常见的。Gutierrez等[21]构建了T-ALL的第二个条件转基因斑马鱼模型，该模型不是基于Cre/lox系统而是由他莫昔芬诱导，在该条件转基因斑马鱼模型中，用4-羟基他莫昔芬诱导后，Myc被激活，从而使斑马鱼发生T-ALL，并且4-羟基他莫昔芬的撤除导致T-ALL细胞凋亡和肿瘤消退；同时还发现，斑马鱼PTEN基因的功能缺失突变或组成型活性Akt2转基因的表达在4-羟基他莫昔芬撤除后可促进疾病进展；此外，Myc降低了PTEN在信使RNA水平的表达，表明Myc下游的PTEN-PI3K-Akt通路激活是肿瘤进展的原因。通常在T-ALL中激活的另一途径是Notch途径。为了研究Notch信号转导激活后诱导白血病的分子机制，Chen等[22]构建了由人Notch1诱导的T细胞白血病斑马鱼模型，在该模型中，rag2启动子驱动Notch1的胞内部分表达，从而诱导疾病发生，44%的斑马鱼在诱导约5个月时发生T淋巴细胞增生性疾病，肿瘤细胞广泛侵入斑马鱼的所有组织，将诱导斑马鱼中的肿瘤细胞移植到受辐射的受体斑马鱼中时，受体斑马鱼发生侵袭性和致命性白血病；此外，当该转基因系与另一种过表达斑马鱼Bcl-2基因系杂交时，白血病发病显著加速，表明Notch途径和Bcl-2介导的抗凋亡途径之间有协同作用。通过这些转基因斑马鱼模型人们已经对白血病的发病机制产生了重要的见解，并且这些模型已经用于化学筛选和移植实验，旨在进一步认识T-ALL的生物学过程。

3.2髓性白血病的转基因斑马鱼模型 在斑马鱼ALL模型取得初步成功之后，科研工作者开始努力在斑马鱼中重现髓系恶性肿瘤，包括骨髓增生性肿瘤(myeloproliferative neoplasms，MPN)和急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)。许多血液系统恶性肿瘤由染色体转位后产生的致癌融合基因驱动。染色体转位后产生的这些融合基因通常可以在动物模型或细胞系中表达以驱动肿瘤发生。因此，大多数MPN和AML转基因斑马鱼系是通过在斑马鱼体内表达人类常见的致癌融合基因和突变基因所构建的。有学者用启动子spi-1驱动EGFP和MYST3/NCOA2融合基因的表达构建了AML的第一个转基因斑马鱼模型，证明了MYST3/NCOA2融合基因的致癌效力；在斑马鱼胚胎单细胞期注射MYST3/NCOA2-EGFP融合基因后14和26个月，表达MYST3/NCOA2-EGFP的转基因斑马鱼中有1.1%发生了AML，这种白血病的特征在于骨髓原始细胞对转基因斑马鱼肾脏的广泛侵袭[23-24]。

NUP98-HOXA9融合基因[t(7; 11) (p15; p15)]与AML和慢性粒细胞白血病的预后不良有关[25]。Forrester等[26]用spi-1启动子驱动NUP98-HOXA9融合基因表达构建了Cre/lox诱导型转基因斑马鱼系(spi1:loxP-EGFP-loxP；NUP98-HOXA9)；在胚胎期，NUP98-HOXA9过表达导致NUP98-HOXA9转基因斑马鱼造血功能改变，包括髓样细胞大量扩增、红细胞减少和骨髓分化抑制；在成年期，23%的NUP98-HOXA9转基因斑马鱼在19～23个月时发展成MPN。

在髓系恶性肿瘤中，HRAS基因突变比KRAS基因突变更频繁，而NRAS基因突变很罕见，但在AML中NRAS基因经常上调且被认为是AML不良的预后标志物[27-28]。Alghisi等[27]在造血出现之前诱导HRAS突变基因在生血内皮中表达构建了转基因斑马鱼系(fli1：GAL4-FF；UAS-GFP-HRASG12V)，这个转基因系斑马鱼尾部造血组织显著扩增，未成熟的造血细胞数量增加以及肾髓中出现骨髓分化块，与人类MPN类似。Shen等[29]创建了表达鼠n-Myc基因同时驱动EGFP表达的热休克反应性转基因斑马鱼系MYCN：HSE：EGFP，在热休克后，n-Myc过表达促进未成熟的髓样细胞扩增，并增强骨髓细胞的再增殖活性。

核磷蛋白1(nucleophosmin 1，NPM1)的突变发生在约27%的AML病例中[30-31]，而FMS样酪氨酸激酶3(fms-like tyrosine kinase 3，FLT3)基因内部串联重复突变(internal tandem duplication，FLT3-ITD)也是AML中的常见突变，与预后不良和复发风险增加相关[32-33]。Lu等[34]试图通过构建spi1启动子驱动的spi1：FLT3-ITD-2A-EGFP和spi1：NPM1-Mut-PA两个转基因斑马鱼系来研究AML中这两种突变的相互作用，FLT3-ITD突变体6个月时出现中度髓样高纤维化，其中一部分鱼在9个月时发展为白血病，NPMc+突变体具有正常的造血组成，然而，FLT3-ITD和NPMc+的双突变体在6个月内进展为白血病，证明它们在驱动AML中具有协同作用。

c-cbl基因经常在MPN和急性白血病中发生突变，并通过抑制生长因子和细胞因子信号起到肿瘤抑制因子的作用。通过大规模的乙酰基亚硝基脲诱变筛选，Peng等[35]最终确定了一个在造血器官中人HSCs显著增加的系，该系发生了c-cbl基因突变，被命名为LDD731：CBLH382T；该突变在-15 dpf时是纯合致死的，并导致定向造血中骨髓/红细胞谱系的扩增；与在小鼠和人中观察到的一致，在该系中FLT3对于骨髓/红细胞谱系的扩增是必需的，表明FLT3信号转导促进人HSCs增殖并且受c-cbl调节。

cAMP应答元件结合蛋白(cAMP response binding protein，CREB)是AML中另一种经常上调的基因，然而，尚不清楚其单独的过表达是否足以诱导白血病的发生。Tregnago等[36]用spi1启动子构建了一个过表达CREB的斑马鱼模型，在该模型中，79%转基因成鱼的骨髓细胞生成中断，66%进展为单核细胞白血病(潜伏期9～14个月)，该模型显示出与20个儿科AML有关的差异表达基因相同的转录特征，包括CCAAT-增强子结合蛋白δ。

为了研究干扰素调节因子8(interferon regulatory factor 8，IRF8)在骨髓瘤形成发病机制中的作用，Zhao等[37]通过功能性敲除IRF8创造了一个错义突变IRF8Δ57/Δ57，IRF8是骨髓谱系分化的关键转录调节因子，与髓系白血病密切相关，IRF8突变体骨髓异常增生，移植后复发，并侵入骨髓，迅速形成MPN，骨髓异常增生是由增殖增加和细胞凋亡减少引起的；在IRF8突变体中，c-Mer原癌基因酪氨酸蛋白激酶的表达增加，从而导致胞外信号调节激酶途径的过度活化，最终导致骨髓瘤形成，并且敲低c-Mer原癌基因酪氨酸蛋白激酶可逆转IRF8突变体的骨髓扩张。这些研究提示，c-Mer原癌基因酪氨酸蛋白激酶信号转导过程在IRF8介导的髓样增殖和生存调节中是关键的。

基于大多数白血病癌基因对造血功能产生的影响可早期检测以及斑马鱼模型的一些固有优势，可以用白血病转基因斑马鱼模型的胚胎开发药物筛选。Yeh等[38]用热激蛋白70启动子控制AML1-ETO融合癌基因的表达开发了一种药筛模型，在这个模型中，当发生热休克后，胚胎中大量未成熟胚细胞累积，Runx1(Runt related transcription factor 1)和c-Myb表达消失，定向造血功能被破坏，表达gata1的红系细胞消失，并最终导致髓系细胞异常扩增。以上这些影响都是AML1-ETO抑制scl所导致的，并且可以通过scl过表达逆转。表达AML1-ETO的斑马鱼胚胎的转录特征与人类AML的转录特征类似，根据斑马鱼胚胎造血受影响的情况和AML转录特征，该研究组进行了可以逆转AML1-ETO效应的抑制剂的化学筛选[39]。

3.3人源白血病的斑马鱼异种移植模型 肿瘤移植是了解癌症病理生理学的重要技术。鉴于其超强的繁殖力和独特的成像优势，斑马鱼成为理想的移植模型。Pruvot等[40]是建立斑马鱼异种移植模型以探索不同抗白血病药物功效和毒性的早期研究者，他们通过将不同的、从AML患者体内分选出来的白血病细胞系(包括K562、Jurkat和NB4细胞)注射到48 hpf斑马鱼胚胎的卵黄囊中进行了一系列实验，值得注意的是，用荧光标记的肿瘤细胞在斑马鱼胚胎的循环系统中保留数天而不影响它们的发育，移植K562细胞的受体鱼进行甲磺酸伊马替尼药物处理后K562细胞数量减少。为了更好地量化药物治疗后白血病的缓解，Corkery等[41]开发了一种有效的方法来测量移植后斑马鱼胚胎中肿瘤细胞的数量变化，简而言之，在异种移植和药物处理后，将胚胎酶促解离成单细胞悬浮液，然后，经过核共染色后在显微镜下计数悬浮液中荧光细胞的数目，以确认白血病细胞的计数。在白血病中，白血病干细胞的消融对于永久地根除白血病细胞群是必要的，然而，由于白血病细胞群中可用于动物建模的白血病干细胞数量非常少，以及白血病干细胞的病理生理功能无法在培养条件下得到证实，白血病干细胞抑制剂开发困难。Zhang等[42]开发了一种新的基于表型的白血病干细胞斑马鱼异种移植检测方法，从用荧光蛋白标记的K562细胞中纯化醛脱氢酶阳性细胞，然后将其移植到受精后48 h的斑马鱼胚胎中，移植后24 h，用不同治疗药物处理受体斑马鱼，通过高含量细胞分析成像判断癌细胞增殖和细胞迁移，在测试的药物中，除Imatinib和Dasatinib外，所有药物均选择性抑制白血病干细胞异种移植斑马鱼中的醛脱氢酶阳性细胞增殖和肿瘤细胞迁移。总之，以上这些研究提供了令人信服的证据，即在斑马鱼胚胎中进行血液肿瘤细胞移植可能是药物研发的有用工具，也是定义患者特异性疗法的预测平台。

4 小 结

自2003年第一个斑马鱼T-ALL模型诞生[19]以来，斑马鱼对白血病的研究做出了巨大贡献。目前已经构建了多种不同的转基因斑马鱼来模拟各种人类造血系统恶性肿瘤疾病。研究人员利用斑马鱼进行了小分子药物高通量筛选，并鉴定了多种具有抗白血病活性的药物，包括Nimesulide、lenaldekar和Perphenazine[39，43-44]。用斑马鱼模型进行疾病研究的进展消除了之前关于它们在癌症研究中实用性的初步怀疑。展望未来，可以使用斑马鱼进行更多的研究。虽然目前能成功地用斑马鱼胚胎进行小分子药物筛选，但筛选过程仍然受限于需将胚胎手动分配到各个组以及异种移植模型时需手动进行胚胎注射。未来这些程序的自动化和标准化将实现真正的高通量小分子筛选，最终促进个性化医疗。