糖尿病肾病和miRNA相关性的研究进展

宋 鑫 刘云启

滨州医学院附属医院肾内科，山东省滨州市 256603

糖尿病是一种异常的代谢性疾病，糖尿病患者数量的持续增长以及其并发症即DN的出现终将对个人及家庭经济产生巨大的负担，而目前尚无法提前预测DN的出现及有效治愈DN。当前临床工作中，DN是根据患者临床症状及尿的化验进行常规诊断的，例如蛋白尿，范围从微量白蛋白尿(30～300mg/d)到大量白蛋白尿(≥350mg/d)。然而，蛋白尿的发生也可以出现在其他肾脏疾病中，如膜性肾病，因此我们无法得知糖尿病患者出现了蛋白尿是并发了DN还是单纯的糖尿病合并其他肾脏疾病，这也说明尿蛋白、eGFR等检查在诊断DN方面的敏感性和特异性较差。因此发现能够对DN进行早期诊断，尽早评估肾脏损伤程度的新型生物标志物对于减少人类慢性肾脏疾病的负担是极其重要的。在DN的实验模型中，发现miRNA与内皮细胞和心血管功能障碍相关。因此，miRNA符合用作诊断糖尿病及其血管并发症的生物标志物的标准。

1 DN介绍

DN是糖尿病最常见、最严重的慢性微血管并发症之一，主要是以肾小球基底膜增厚、系膜细胞增生、足细胞纤维化和凋亡为病理特征，随着病情进展可出现肾小球结构和功能的异常。根据DN的病程及生理演变过程，可分为5期，早期主要表现是微量白蛋白尿，容易被忽视。通常于第4期出现明显的临床表现，如钠水潴留导致肢体肿胀、大量蛋白尿及因血液中低氧导致的疲劳和恶心等症状。如不及时治疗，就会进展至第5期——ESRD，此时肾脏功能衰竭，有效的治疗方法为肾透析或肾移植[1]。随着糖尿病患病率的增加，透析患者中一半以上为DN，它与心血管死亡事件的高风险性息息相关。

2 miRNA介绍

自从1993年miRNA首次被Lee等人发现以来，至今为止已发现2000多种人类miRNA[2]。miRNA属于非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA)的一种，其成熟形式为单链RNA分子，长度为18～25个碱基，其序列在动物物种中具有高度保守性。miRNA主要是通过降解信使RNA或抑制蛋白质翻译来调控转录后基因表达，在细胞增殖、凋亡、迁移、分化和自噬等多种生物学过程中发挥重要作用[3]。研究表明，miRNA表达的失调与多种疾病的发生与发展有关，如糖尿病及其并发症(糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变)、心血管疾病(心肌病、动脉粥样硬化)、肾脏疾病(肾纤维化、多囊肾)以及大多数癌症[4-5]。现就不同miRNA(miR-21、 miR-192、miR-451、miR-23b、miR-27、miR-R17)调节对DN的影响进行综述。

3 miRNA与糖尿病肾病

3.1 miR-21 研究表明miR-21通过靶向作用于肾组织的PTEN(磷酸酶和张力蛋白同源基因)和smad7促进肾脏纤维化。另外发现过表达的miR-21可以下调smad7/p-smad7和上调smad3/p-smad3的表达来增强TGF-β1诱导的上皮间充质转化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)，而通过抑制miR-21不仅能够阻止EMT和肾纤维化的进展，还能改善DN的肾脏结构和功能[6]。Malte等人[7]研究发现，在DN中miR-21集中存在于肾小球细胞，通过靶向细胞分裂周期25a和细胞周期蛋白依赖性激酶-6能够阻滞细胞周期并促进系膜细胞(Mesangial cell，MC)肥大，还能通过调节PTEN导致足细胞功能障碍。这意味着抑制miR-21的表达可作为一种有效的治疗手段来缓解DN肾脏纤维化。然而，Jennifer等人[8]的研究结果显示，在DNA损伤和Tgfb1-TG小鼠模型中，miR-21的缺失可以加速肾小球损伤和足细胞凋亡，表明miR-21的表达在肾小球损伤中具有保护作用。他们的研究结论存在分歧可能与研究标本不同、样本量差异等因素有关，miR-21与DN之间的联系还需要我们继续进行探究。

Wang等人[9]研究报道，在DN小鼠模型中，血清miR-21表达与尿微量白蛋白与尿肌酐比值(ACR)呈正相关，与肌酐清除率(Ccr)呈负相关，miR-21抑制剂不仅可以降低血清miR-21和ACR，还可以升高Ccr。同时，血清中的miR-21与肾组织中的变化趋势相一致，直接检测血清miR-21可以替代检测肾组织miR-21。结果表明血清miR-21的变化可以间接反映肾脏功能，可以作为诊断DN的生物标志物，同时抑制miR-21的表达也不失为一种治疗DN的有效手段。

3.2 miR-192 高糖毒性下，肾脏缺乏自噬活性，使得肾脏细胞更易受到损伤。Supriya等人[10]研究发现，miR-192在DN的自噬过程中起着重要的调节作用。在DN小鼠模型中，miR-192的过表达可以抑制小鼠肾小球MC中的自噬，用LNA-anti-miR-192寡核苷酸抑制miR-192的表达或敲除miR-192可逆转其对自噬的抑制以及减少肾小球MC肥大，这说明miR-192的过表达可以促进DN的发展。Liu等人[11]在DN大鼠模型中观察到miR-192的表达与早期生长反应基因-1 (Egr-1)的表达呈现相关性，Egr-1可通过促进系膜细胞增殖、促进TGF-β1的表达、加速肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化等多种途径参与肾脏纤维化。他们推测miR-192可能在DN进展中起到启动子的作用，通过负调控Egr1的表达从而延缓肾小管间质纤维化(Tubular interstitial fibrosis，TIF)的进展。他们的发现表明miR-192在DN中具有肾脏保护作用。上述两组人研究结果有所不同，这可能与miR-192在不同的动物模型及细胞系中的差异性表达有关。

Yang等人[12]研究表明随着DN的进展，尽管miR-192在血清中的表达降低，但其在尿液中的表达却是升高的。无论在血清还是尿液中，miR-192的AUC-ROC均高于ACR，并且ACR中的尿蛋白含量主要与肾小球硬化所致的滤过膜通透性增加有关，受人体内总蛋白、器官功能、机体状况和情绪等多种因素的影响，而血清和尿液中的miR-192则较稳定，几乎不被降解，这表明比起临床上常用的检测指标ACR，miR-192能更好地评价肾脏损伤程度。

3.3 miR-451 Ywhaz编码的蛋白属于14-3-3蛋白家族，是一组高度保守的蛋白，在细胞凋亡和细胞周期调控中起重要作用，它既是糖尿病相关基因，也是miR-451的靶基因。MAPK通路是公认的糖尿病相关信号传导通路，它可以促进炎症和纤维化反应，Ywhaz可刺激苏氨酸/丝氨酸激酶raf1的活化，使MAPK磷酸化，引起细胞生长、分化、癌变[13-14]。miR-451可以通过mRNA 3’非翻译区(3’UTR)负调控Ywhaz的表达，进而影响Ywhaz/MAPK信号传导通路，下调MAPK信号通路关键蛋白p-p38 MAPK和p-MKK3表达，从而抑制高糖诱导的系膜细胞增殖[15]。因此，miR-451可能在DN的发病中起保护作用。大型多功能蛋白酶7(LMP7)是一种免疫蛋白酶体亚单位，可以激活核因子-κB(NF-κB)，而NF-κB的活化在DN的进展中起重要作用。Sun等人[16]发现miR-451过表达可以直接抑制LMP7的表达从而抑制NF-κB的活化，进而影响其与DN相关的促炎症因子(如TNF-α、IL-18、MYD88、ICAM-1等)启动子结合，从而下调系膜细胞中促炎症因子的转录。进一步研究发现在miR-451调控NF-κB活化的过程中，LMP7是一个不可缺少的中间作用因子，当LMP7活性被抑制的时候，调节miR-451的表达并不能影响NF-κB的活化。这些结果表明miR-451可以通过调控LMP7/NF-κB通路在DN进展中发挥作用[17]。

3.4 miR-23b Zhao等人[18]在DN小鼠中发现P53是miR-23b启动子的结合位点，通过抑制P53或上游的p38 MAPK可增强miR-23b的表达。GTP酶活化蛋白2(Ras GTPase-activating protein-binding protein 2，G3BP2)是miR-23b的作用靶点，通过抑制G3BP2的表达可观察到miR-23b表达的增强以及P53和P38 MAPK表达的减少。他们推测高血糖可能是通过miR-23b/G3BP2反馈回路来抑制P53和P38 MAPK的表达，进而参与DN的发病，而miR-23b发挥作用的主要机制是通过作用于P38 MAPK来减少细胞外基质蛋白堆积所致的系膜扩张。这些发现揭示了miR-23b在DN中的保护作用。有相关报道，TGF-β1诱导的EMT过程在DN肾脏纤维化的发生和发展中起主导作用，而高迁移率族蛋白A2(High mobility group A2，HMGA2)则通过多种机制参与TGF-β1介导的EMT[19]。另外，研究[20]发现高糖环境下的肾脏EMT与miR-23b的表达降低相关，而miR-23b高表达可以通过抑制HMGA2的表达来抑制PI3K/AKT信号通路的激活，进而减弱糖尿病肾脏EMT，改善肾脏形态、肾脏纤维化和肾功能，并防止高血糖环境下DN的发生和发展。这些发现提供了miR-23b作为EMT抑制剂的证据，增加miR-23b的表达可能有助于DN的治疗。

3.5 miR-25 Li等人[21]发现在高糖环境下培养的人近端肾小管上皮HK-2细胞中miR-25呈时间依赖性下降。miR-25过表达能减少活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的产生并抑制高糖诱导的细胞凋亡以此来保护HK-2细胞，它的抗凋亡作用依赖于PTEN/AKT通路的激活。PTEN既是一个经典的促凋亡基因，同时也是miR-25的一个直接和功能性靶标，在DN患者的肾活检组织样本中可看到PTEN表达上调。过表达的PTEN可以消除miR-25对ROS产生和细胞凋亡的抑制作用，这说明PTEN的过表达可以逆转miR-25对肾小管上皮细胞损伤的保护作用。他们的发现提示过表达miR-25可能有助于DN的治疗。Liu等人[22]发现在DN小鼠中，miR-25过表达可通过抑制足细胞功能障碍和氧化应激来减少蛋白尿和减弱肾小球纤维化，同时还能抑制RAS系统来降低肾性高血压，并且这种对RAS系统的抑制作用并不是通过影响氧化应激产生的。而在正常小鼠中抑制miR-25表达则会导致肾脏纤维化增加、足细胞塌陷、蛋白尿和高血压，miR-25的过表达可逆转这些不良表现。因此，从DN的治疗角度来看，增强miR-25的表达是有利的。

3.6 miR-217 Sun等人[23]研究发现，在高糖环境下培养的足细胞中miR-217表达增加，通过抑制miR-217的表达可减弱高糖对细胞活性的抑制作用，还能抑制细胞凋亡和ROS产生。在进一步的研究中他们还发现PTEN在足细胞中是miR-217的作用靶点，可以抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活来增强自噬，进而保护足细胞，而通过抑制miR-217的表达可增强PTEN介导的自噬，以此来改善高糖环境下的足细胞损伤和胰岛素抵抗。上述研究发现表明通过抑制miR-217的表达可以对DN的发展起到阻碍作用，是一个潜在的DN治疗靶点。

4 小结与展望

DN的进展是一个长期过程，随着病情的加重终会发展至尿毒症，最终离不开透析治疗。近年来，随着人们对miRNA认识的不断加深，发现其在多种疾病包括DN中扮演着重要角色。由于miRNA在血液和尿液中都比较稳定，因此通过检测miRNA水平来诊断早期DN有较好的效果。同时，miRNA在DN发病中的作用机理也逐渐被我们所了解，它可以通过调控多种信号通路来影响DN的进程，并且通过增强或抑制不同的miRNA的表达可以对DN的进展起到阻碍作用。虽然目前对miRNA和DN关系的研究越来越深入，包括大量的体外细胞实验及动物体内实验，但miRNA在DN临床方面应用的研究仍处于初级阶段，需要我们继续去探索。