Micro RNA在缺血性卒中后炎症反应中的研究进展

励志英

天津中医药大学第一附属医院针灸部，天津市 300000

Micro RNA(miRNA)是一类小型非编码RNA，长度为18～25bp，与其靶mRNA结合后，能够在转录水平直接调节基因表达，在许多细胞生物学和分子通路中起着核心调控作用。大量证据表明，miRNA参与增殖、造血、代谢、免疫功能和卒中后抑郁等多种疾病的生理和病理过程的调控[1]。近年来临床及动物实验均发现，卒中后miRNAs表达谱异常，miRNAs是促进缺血性卒中发生、发展的关键介质。目前，已有研究者提出将miRNAs列为卒中的新型生物标志物，用于卒中的诊断、治疗、预后评价。最新研究表明，使用间充质干细胞衍生的外泌体来表达miRNAs，用于治疗卒中等各种疾病，并取得了较好的效果[2]。

1 脑缺血后脑内的炎症级联反应

脑缺血/再灌注损伤引起脑内一系列复杂的病理生理学级联反应，包括多种细胞生物学过程出现异常。在缺血阶段，由于血液供应迅速减少导致细胞正常离子梯度破坏、细胞兴奋性毒性和神经元死亡；而在再灌注阶段，氧的恢复导致氧化应激损伤；血流的恢复导致炎症和水肿，也进一步增加了缺血组织神经细胞变性、坏死的风险。

近年来，脑缺血后的炎症反应逐渐受到重视。缺血后，脑内小胶质细胞首先被激活，释放TNFα等致炎因子，并形成持续放大的炎症级联反应[3]。缺血还使血管内皮活化，表达趋化因子及黏附分子加重炎症反应；并释放MMP9等破坏血脑屏障[4]。在趋化因子等的作用下，循环中的白细胞(如中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞)等通过损伤的血脑屏障侵入脑实质，促使胶质细胞进一步活化并协同产生更多的炎症因子，加重神经损害。如中性粒细胞、单核/巨噬细胞能生成活性氧和TNFα等致炎因子，促进小胶质细胞分泌致炎因子，使神经损伤加剧。中性粒细胞还表达MMPs破坏血脑屏障，进一步促进炎性细胞浸润；中性粒细胞本身还发生粘附聚集，阻塞微血管，引起继发血栓[5]。

从时间上来看，缺血后几分钟炎症反应就已经启动，缺血后3h内缺血区就可见中性粒细胞浸润，并一直持续至再灌注后的24h。大量前炎症介质，如化学因子和细胞因子等的爆发性表达也有着同样的时间规律。对卒中动物的研究表明，抑制中性粒细胞引起的炎症反应可减少脑缺血后神经变性，并改善神经功能。但同样的抗炎治疗在卒中患者上却未得到类似的疗效。

2 miRNAs表达水平在脑缺血后出现变化

多种miRNAs的表达水平在脑缺血后很快就出现显著变化，甚至缺血后30min内就出现改变。大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠模型，其缺血皮层中的许多miRNAs(如miR-155、miR-297a、miR-466f、miR-466h和miR-1224)在MCAO后24h内显著上调。Liu等[6]以MCAO大鼠为模型，于缺血后0～168h的不同时间点分析脑组织miRNAs表达谱。共发现346个差异表达的miRNAs，其中miR-21、miR-142-3p、miR-142-5p和miR-146a在缺血后48～168h较急性期(0～24h)显著上调；而miR-196a/b/c、miR-224和miR-324-3p的表达趋势则相反。此外，miR-206、miR-290、miR-291a-5p和miR-30c-1*从0～24h增加，随后从48～168h逐渐减少，且表达量与梗死面积呈正相关。

3 miRNAs调节脑缺血后的炎症反应

许多miRNAs被证实可调节脑缺血后的炎症反应，其调节炎症的主要机制是调控靶细胞中细胞因子的表达。

3.1 miRNAs对缺血后神经元的影响 Yu等[7]在糖氧剥夺的条件下培养皮质神经元，转染腺病毒使其过表达miR-22，可降低神经元表达促炎因子TNF-α、IL-6、COX2和iNOS的水平，提高抗炎细胞因子IL-10的水平。此外，miR-22还可降低短暂局灶性脑缺血引起的炎症、梗死灶体积、神经功能损伤。miR-22对炎症的调节是通过降低NF-κB协同激活因子(NCOA1)的表达，进而显著抑制NF-κB活性实现的。此外，miR-22通过抑制Caspase 3活性，增加抗凋亡基因bcl-2表达而降低凋亡基因bax表达，进而降低皮层神经元的凋亡。

抑制NF-κB表达已经被证实具有诱导脑缺血后神经保护的作用。其他miRNAs对炎症的调控作用也与NF-κB通路关系密切，但受其调节的靶mRNA仍不清楚。缺血性脑损伤可诱导内质网应激及细胞内Ca2+平衡紊乱。葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein 78, GRP78)是内质网应激的标志蛋白，也是NF-κB的激活因子，其在应激状态下表达提高，以维护内质网正常功能及维持细胞内Ca2+平衡。miR-181a过表达可诱导GRP78表达增加，从而加剧缺血损伤。Xu等[8]以MCAO大鼠为模型，通过侧脑室和静脉给药途径观察miR-181a拮抗剂的作用。发现miR-181a拮抗剂治疗后，脑梗死面积明显缩小，神经功能缺损改善；抑制miR-181a表达还可降低NF-κB活化和白细胞中枢浸润，且治疗效果至少能维持1个月。miR-181a拮抗剂的靶点包括bcl2和x连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)。

miRNAs是调控Toll样受体信号通路的重要因子。骨髓分化因子88(MyD88)是Toll样受体、IL-1受体等的关键下游配体，能介导NF-κB的核易位。miR-203过表达可通过降低MyD88水平，进而抑制下游NF-κB信号传导；miR-203能抑制炎症因子IL-8和TNFα的分泌，从而减弱缺血后的炎症反应，减少糖氧剥夺导致的神经元死亡[9]。

具有系统性高炎症因子水平的卒中患者，其神经功能恢复较差。对31例急性缺血性卒中患者的血清miRNAs分析结果显示，卒中后miR-124和miR-9水平下降与较大的梗死体积、增加的炎症因子水平呈负相关，这些炎症因子包括基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和高灵敏度C反应蛋白(hs-CRP)[10]。MMP-9可致脑微血管内皮细胞间紧密连接和基底膜破坏，BBB 通透性增加。hs-CRP则与卒中及神经功能缺损严重程度相关。

提取急性缺血性卒中患者(n=50)血样中的外显子进行分析，发现患者外显子中miR-223的表达较对照组明显升高，并与NIHSS评分呈正相关。预后差的脑卒中患者外显子miR-223水平高于预后好的患者。提示外显子miR-223增多与急性缺血性卒中的发生、卒中的严重程度和短期预后有关[11]。

3.2 miRNAs对缺血后小胶质细胞的影响 体外研究进一步表明，miR-124过表达减少了实验性变态反应性脑脊髓炎模型体内TNFα等炎症因子的水平，并抑制了小胶质细胞的活化。小胶质细胞是脑内固有的免疫细胞，其对缺血损伤后的炎症信号高度敏感。小胶质细胞激活后，会释放ROS、前炎症因子、细胞因子以及蛋白水解酶以介导脑损伤[3]。虽然小胶质细胞适度激活是神经可塑性和清除坏死神经元所必需，但其过度活化则导致脑缺血后的神经毒性和脑损伤。很多miRNAs可调节小胶质细胞的活化，并对缺血后脑组织产生保护作用。在永久性MCAO的啮齿动物模型中，miR-424过表达可抑制小胶质细胞的活化，并减少梗死灶体积[12]。体外实验中，miR-424通过在翻译水平抑制细胞周期因子(如cyclin D1、细胞分裂周期25A和细胞分裂蛋白激酶6等)来抑制小胶质细胞激活[12]。糖氧剥夺诱导的小胶质细胞活化需要MyD88的介导，采用miR-203过表达来抑制MyD88，防止了糖氧剥夺后小胶质细胞的激活和神经元损伤；而脑内给予miR-203模拟剂，能下调MCAO大鼠脑内MyD88水平，并减轻了炎症反应及继发性脑损伤[9]。

除了调节NF-κB信号通路，miR-181a还参与调节小胶质细胞的活化。采用miR-181a拮抗剂治疗，可减少缺血后小胶质细胞标志蛋白Iba1的水平，并减少MCAO后的神经变性损伤[8]。

3.3 miRNAs对缺血后星形胶质细胞的影响 有证据表明，miR-181影响脑缺血后炎症反应的作用与星形胶质细胞有关。在培养的星形胶质细胞的体外炎症模型中，抑制miR-181导致前炎症因子水平增加(如TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8和高流动性组盒-1蛋白)，而miR-181过表达则增加了抗炎因子IL-10的水平[13]。

采用骨髓相关蛋白-8(MRP8)在体外诱导星形胶质细胞的炎症反应，发现miR-132、miR-146a和miR-155水平变化；同时可见TLR4和下游炎症因子水平明显上调。miR-132通过调控靶向IL-1受体相关激酶4(IRAK4)水平，进而负反馈调节IL-1β和IL-6的水平，而不是传统认为的TNF-α。该结果也提示miR-132在神经系统疾病中内源性配体诱导的固有免疫应答调节中的重要性[14]。

3.4 miRNAs对缺血后少突胶质细胞的影响 新生少突胶质细胞参与缺血性脑损伤的修复。采用成年MCAO模型大鼠，发现缺血侧脑室胼胝体和室下区miR-146a的密度显著增加。在体外，神经前体细胞(NPCS)过表达miR-146a，可促进其少突胶质细胞分化。在原代少突胶质细胞中过表达miR-146a则增加了髓鞘蛋白的表达，而内源性miR-146a的减少则抑制了髓鞘蛋白的生成。miR-146a也负调节少突胶质细胞中靶基因IRAK1的表达。IRAK1的减少能显著增加髓鞘蛋白的生成，并减少少突胶质细胞的凋亡。提示miR-146a可能介导了卒中诱导的少突胶质细胞的生成[15]。

在体外，miR-17-92基因簇能促进少突胶质细胞形成、神经发生和轴突生长。Xin等[16]采用MCAO大鼠，静脉注射富含miR-17-92基因簇的多能间充质干细胞外显子，并以普通多能间充质干细胞外显子做对照，于28d后观察树突、轴突、突触和髓鞘重塑的变化，发现富含miR-17-92基因簇的外显子治疗能改善神经功能，并促进缺血半暗带区域的少突胶质细胞形成、神经发生和神经树突重塑。

总之，miRNAs参与了脑缺血后的神经炎症反应的调控。由于miRNAs可以靶向细胞内多个调控网络中的数百种蛋白质，并对各类神经细胞产生影响，因此通过特异性药物和非药物治疗抑制参与多种致病机制的miRNAs表达，可能有利于脑卒中后的康复。