高通量测序技术在牙周微生物群落研究中的应用

杨万娟，徐杰

(昆明医科大学附属口腔医院牙周病科，昆明 650106)

近年来，检测唾液、菌斑中微生物的高通量测序技术被广泛应用于口腔内多种疾病的研究，并取得了一定进展[1-3]。牙周炎是一组临床表现为慢性炎症和牙齿周围支持组织破坏的疾病，始动因素为牙菌斑生物膜。通常牙周菌群之间及其与宿主之间维持着动态平衡，若牙周微生态失衡，则牙周炎开始发生发展，此时的微生态环境和微生物群落组成较牙周健康时更复杂。牙周炎是感染性疾病，但其与病因学有关的微生物成分和宿主反应成分尚未完全明确，因此，对与牙周炎相关菌种进行分类，并对牙菌斑生物膜中微生物之间的关系进行阐述，有助于理解微生物之间的联系及致病机制[4]。高通量测序技术的发展使群落组成和结构成为牙周微生物研究的新方式之一，可用于牙周炎、种植体周围炎相关微生物的研究，该技术凭借高通量、高效率和高准确度的优势，能够全面细致地了解牙周微生物群落的组成和结构，有利于更好地理解牙周微生物之间的相互关系，并能从复杂的微生物群落中寻找优势菌群，探索牙周炎与全身疾病之间的关系，指导临床诊断及疾病防治，为牙周病的病因学发展提供帮助[5-7]。现对高通量测序技术的原理、特点及其近年来在牙周微生物群落中的研究及应用予以综述。

1 牙周微生物

口腔中有超过500种微生物定植在龈下菌斑生物膜中，组成了复杂的牙周微生态环境[8]。其中大部分细菌为口腔正常菌群，仅牙周致病菌具有显著的毒力。当前公认的牙周致病菌主要有11种：牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)、福赛坦氏菌(Tannerela forsythia，Tf)、齿垢密螺旋体、伴放线聚集杆菌、直肠弯曲菌、缠结优杆菌、聚核梭杆菌、中间普式菌(Prevotella intermedia，Pi)、变黑普式菌(Prevotella nigrescens，Pn)、微小微单胞菌和中间链球菌。研究表明，牙周机械治疗后，牙周致病菌较临床指标的变化更早[9]，因此牙周微生物的检测对疾病的治疗与预后评估有指导意义。然而，与典型细菌感染不同，在大多数牙周炎病例中，随着疾病的发展，微生物群落的多样性也会增加。复杂的微生物群落使针对某个特定牙周致病菌的治疗难以达到治疗目的[10]，牙周病的治疗目标不是消除口腔微生物群落，而是选择性地支持有益菌种的生长，并减缓菌斑生物膜的生长和新陈代谢，减少牙周微生态失调的发生[11]。因此，选择合适的方法检测牙周微生物，了解群落的组成和多样性，有助于进一步探索牙周微生物之间的相互作用，并为疾病的治疗和预防提供参考。

2 高通量测序技术

2.1原理 高通量测序技术通过引物延伸、检测新加入核苷酸、以化学或酶的方法清除反应底物或荧光源等一系列重复步骤进行测序，同时检测每个片段群进行反应所产生的信号，“大规模并行测序”可以使数十万乃至数亿个测序反应同时进行并被同步检测[12]。因此，该技术能够一次检测成百上千万的基因序列，并通过完整的序列信息，全面细致地对基因组进行测序[13]。

2.2特点 高通量测序技术具有高输出量与高解析、高效率和高精确度的特点[14]。与细菌培养、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)等检测技术相比，高通量测序技术可以一次性同时检测多种微生物，高效省时。传统的细菌培养法是微生物检测的“金标准”，但培养技术和条件复杂，存在一定的局限性[15]。目前，不依赖细菌培养的PCR等技术被广泛应用于牙周微生物的研究，PCR技术可以对一种或几种已知的牙周致病菌进行详细的检测，探究它们与临床指标之间的相关性，但仅通过PCR技术同时检测的细菌有限，而牙周微生物群落复杂多样，细菌之间存在协同或拮抗作用，单纯检测某种细菌无法全面反映各细菌之间的相互作用，因此对微生物群落整体进行研究显得尤为重要[16-17]。随后，研究者开始通过PCR变性梯度凝胶电泳技术分析牙周微生物群落的组成结构，并初步认识群落结构，但图谱的条带容易出现多种细菌混杂的现象，识别细菌的分辨率较低[18-19]。在微生物检测方面，上述技术仅能检测保守区已知的微生物基因序列，当微生物的基因发生重组突变或者需要检测未知的微生物时，这些技术就无法发挥作用。与上述传统检测技术相比，高通量测序技术不仅能够同时检测多种微生物的基因组序列，对微生物进行定性及定量，还能检测低丰度甚至痕量菌种，并可发现未知微生物。但高通量测序技术费用昂贵，在样本处理阶段，该技术对样本DNA的纯度及浓度要求较高[20]；在生物信息分析阶段，由于受到测序平台读长、物种数据库和物种分类软件等的影响，该技术对种水平分类学信息的置信度较低[21]。

3 高通量测序技术与牙周微生物群落研究

由于牙周病是多种微生物混合感染性疾病，而高通量测序技术具有高通量、高效率和高准确度的特点，能够较全面地对牙周微生物群落的组成和结构进行研究，因此，近年来学者们将高通量测序技术用于牙周微生物的检测，并取得了一定的进展。高通量测序技术在牙周微生物检测中的应用使牙周微生物的研究从以往单一特定的菌种研究向群落整体研究转变。高通量测序技术在牙周微生物群落研究中的应用主要包括以下几方面。

3.1牙周炎相关菌群的检测 高通量测序技术能够明确牙周组织在健康或疾病状态下的菌群组成和结构差异，并从微生态角度更具体的检测导致牙周微生态失调的菌群，对于了解牙周炎的发病机制并明确牙周疾病的诊断具有重要作用。在门水平上，拟杆菌门(Bacteroidetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、互养菌门(Synergistetes)和螺旋体门(Spirochaetes)等是牙周炎的优势菌门，变形菌门(Proteobacteria)是牙周健康者的优势菌门，而厚壁菌门是牙龈炎中的优势菌门[22-23]。在属水平上，链球菌属(Streptococcus)在牙周健康者中占主导地位，而牙周炎中的优势菌属主要包括普氏菌属(Prevo-tella)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)和密螺旋体属(Treponema)等[5]，它们均是革兰阴性专性厌氧菌，在龈下菌斑生物膜的定植过程中发挥重要作用。上述研究通过高通量测序技术分别从细菌学的不同分类级别对牙周微生物群落的轮廓进行了详细的描绘，并从更全面的微生态角度证实了牙周健康者与牙周病患者菌群之间的区别，使复杂的牙周微生物群落更加形象具体，了解微生物在不同生态环境中的相互作用，也为进一步确认牙周优势菌提供了更多的可能。

随着牙周炎的进展，疾病可分为轻、中、重度，而探诊深度(probing depth，PD)可在一定程度上反映牙周炎的进展状况，因此对不同PD牙周袋内微生物的相应研究能为牙周炎的治疗及预防提供帮助。研究发现，浅牙周袋(PD≤3 mm)与深牙周袋(PD≥6 mm)内的菌群存在明显差异，放线菌门(Actinobacteria)在深袋内检出率高，浅袋和深袋内的微生物可能还受不同种族、牙位以及吸烟等因素的影响[24-25]。Shi等[20]的研究表明，随着PD的增加，侵袭性牙周炎或慢性牙周炎的细菌丰度均发生改变，某些细菌还与牙周袋深度呈线性相关，慢性牙周炎中与PD呈正相关的有Porphyromonas、产线菌属和支原体等，侵袭性牙周炎中与PD呈正相关有棒状杆菌属(Corynebacterium)、克雷伯菌属等，但在两种牙周炎中某些细菌的变化趋势不同，有时甚至相反，如Corynebacterium，表明不同牙周炎进展阶段的优势菌群也不同，与以往研究某种细菌的致病性不同，通过测序了解细菌在疾病发生发展中的微生物群落的变化，有助于通过调控微生态平衡控制牙周疾病。

高通量测序技术将为深入探究微生物的致病机制提供方向。除了分析牙周炎微生物群落的组成和结构外，高通量测序技术还可以通过分析微生物群落结构的差异推断微生物间的亲缘关系，进行群落功能差异分析。通过测序可以预测包括膜转运、复制和修复、糖代谢、氨基酸代谢及能量代谢等在内的许多细菌代谢功能[26]。Wang等[27]研究亦发现，在牙周微生物群落中，与调控细菌趋化和多糖生物合成有关的许多功能基因和代谢途径呈过表达。Li等[28]通过454焦磷酸测序对来自中国的10例侵袭性牙周炎患者及其直系亲属的微生物群落进行分析，结果显示，家庭成员间微生物群落的组成更加相似，说明中国人侵袭性牙周炎及家属的微生物群落系统发育结构存在亲缘关系，提示中国家庭共用餐具和父母咀嚼喂养婴儿等饮食习惯可能在一定程度上造成牙周微生物在家庭成员间的传播。

与传统检测方法相同，高通量测序可以检测主要的牙周致病菌[29]。研究发现，Pi和Pn可能是龈下菌斑中的“关键物质”，能反映龈下微生态系统中微生物和环境的动态变化，提示可将它们作为预测牙周炎的新的生物标志物[30]。与传统检测方法不同，除检测已知的牙周致病菌外，测序还能检测与牙周炎相关的可疑致病菌，发现新菌种[31]。Torres等[32]通过测序发现了一种新型牙周病相关细菌，该细菌属于拟杆菌属，暂命名为CBP(Candidatus Bacteroides periocalifornicus)，主要存在于深牙周袋中，与红色复合体的关系密切，促使了牙周炎病因学研究的进一步发展。

3.2牙周基础治疗前后菌群变化的检测 牙周基础治疗是所有牙周病患者的必经治疗，旨在消除大部分致病及危险因素，进而控制炎症，稳定病情。通过高通量测序观察基础治疗前后牙周菌群的变化有助于进行疗效评估。Shi等[33]使用宏基因组鸟枪测序，描述了牙周炎患者基础治疗前后龈下微生物组的动态变化，揭示了病原微生物之间的协同作用对疾病发生发展的影响，并提出龈下微生物组可作为疾病诊断和预后的潜在指标。牙周基础治疗后减少的菌群主要是Bacteroidetes、Spirochaetes、Fusobacteria、Pg、Tf和Pi等牙周致病菌，显著增加的菌群主要是Actinobacteria、Proteobacteria、Streptococcus等有益菌[29,34]，提示牙周基础治疗可以明显改变牙周微生物群落的构成，辅助使用抗生素能够显著降低菌群丰度[35]。Laksmana等[36]通过检测基础治疗前后的菌群变化发现，龈下菌群的特征是由少数物种主导的高物种丰度的微生物群落，高通量测序适用于评估牙周微生物群的复杂性和变化。牙周炎是一种静止期和活动期交替发展的疾病，如何确定治疗的有效性，并以此作为依据制订治疗策略是牙周治疗成功的关键。相较于其他仅能分析单一种或几种细菌的传统检测法，采用高通量测序技术能够更全面地分析牙周微生物群的复杂性和变化，可为临床医师的治疗选择提供更多参考。

3.3伴全身性疾病的牙周炎相关菌群的检测 牙周炎与心血管疾病、糖尿病及IgA肾病等多种全身性疾病有关。研究证明，动脉粥样硬化斑块中存在口腔微生物的定植，且动脉粥样硬化伴牙周病患者血管内皮中细菌类群显著高于单纯动脉粥样硬化患者[37]。Saeb等[7]通过测序发现，糖尿病及糖尿病前期患者的牙周微生物群落的生物和系统发育多样性明显低于血糖正常者，该研究结果可能有助于更好地理解牙周炎与糖尿病之间的双向关系。有学者提出，龈下微生物群或许可用于预测慢性牙周炎患者IgA肾病的发病率，由于伴有IgA肾病的慢性牙周炎患者的龈下微生物多样性略高于无IgA肾病的慢性牙周炎患者，且龈下微生物结构的变化与慢性牙周炎患者的IgA肾病发病率之间存在相关性[38]。可见，牙周炎与全身性疾病相关，但尚无关于系统性疾病发病机制中微生物和炎症作用的确切结论，测序通过描绘具体的菌群轮廓可能有助于更深入地认识全身性疾病与牙周炎的关系，为患者提供更个性化的诊疗。

3.4种植体周围炎相关菌群的检测 种植体周围炎也是以菌斑生物膜为始动因子的疾病。若不进行定期维护，5年内种植体周围炎的发生率为43.9%[39]，了解种植体周微生物群落组成和结构，有利于进行种植体周围黏膜炎与种植体周围炎的预防与治疗。种植体周围炎的部位与健康部位的微生态系统不同，Synergistetes与种植体周围炎高度相关[40]。Sanz-Martin等[6]研究发现，种植体周围炎的菌群具有共生体缺失、致病菌富集、传统致病菌和新致病菌并存的特点，且种植体周围炎的核心微生物群是牙周炎相关菌属的一个类群，这些菌群特点只有通过测序才能被发现，若通过测序了解其特点及相互作用，并在此基础上选择性地促进有益菌的生长，可能将为种植体相关疾病的治疗提供帮助。

4 小 结

牙周病是多种微生物混合感染性疾病，随着牙周微生物检测技术的发展，关于牙周病的病因学研究也不断发展。高通量测序技术的发展使牙周微生物的研究不仅仅局限于检测某种特定的牙周致病菌，而是在不同层次牙周微生态细菌分类学的基础上认识牙周微生物群落的组成和结构，了解微生物在牙周病及种植体周围相关疾病发生发展中的作用，揭示牙周病与全身性疾病之间的关系，为疾病的预防及治疗提供参考。高通量测序技术能够进行全面的牙周微生物群落研究，而常用PCR等技术则可以在此基础上对已经筛选出的微生物群落中的特定菌种展开研究，各种微生物检测技术之间相互补充，也为牙周病的病因学研究提供了更多可能。