单细胞RNA测序在间充质干细胞研究中的应用

龙 笑 李竹君

1970年，Friedenstein等[1]在豚鼠的骨髓和脾脏中发现了可以在体外形成成纤维细胞群落、在体内形成异位骨组织的骨祖细胞。对该类细胞的进一步研究显示，它们能够以未分化的状态复制，并具有分化形成多种间充质组织的潜能，包括骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉和骨髓，属于间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)[2]。MSCs是成体干细胞，存在于骨髓、脂肪等多种组织中。国际细胞治疗联合会(International Society for Cellular Therapy, ISCT)提出的体外培养的间充质干细胞表型为：≥95%细胞表达包括CD105、CD73和CD90在内的标志物，≤2%细胞表达包括CD45、CD34、CD14、CD11b、CD19、CD79A以及HLA-DR19[3]。对MSCs的深入研究显示，其具有修复组织损伤、通过分泌可溶性因子调节组织微环境、调节免疫等作用，引起了研究者将其用于干细胞疗法的兴趣[4～6]。MSCs在脂肪组织中含量较高，获取方便，加之伦理学问题少、免疫反应弱等优点，极具应用前景。截至2020年2月，在Clinicaltrials.gov网站检索Mesenchymal stem cells，可以找到1044条已完成或正在进行的间充质干细胞疗法的临床试验。目前，MSCs主要用于脆弱组织的修复重建，包括肌肉骨骼系统、神经系统、心肌、肝脏、角膜、气管、皮肤等[7]。

但是，体外培养的MSCs具有高度异质性及表型不稳定性[8]。来自不同个体、不同组织种类的MSCs具有不同的表型和性质。1999年，Phinney等[9]在小鼠中观察到，不同个体骨髓中MSCs含量差异可达10倍，在成骨分化标志物碱性磷酸酶的表达水平、生长速率、表面标志物等方面也具有较大差异。随后，他们又观察了取自17名健康志愿者髂后上棘的人骨髓MSCs，发现其生长速率差异可达12倍[10]。由于MSCs的异质性和分离技术上的差异，如果应用于大规模临床治疗，效果可能参差不齐[11]。这一点大大阻碍了对它的研究和应用。

单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)技术是打破这一困境的绝佳工具。2009年，Tang等[12]采用显微镜下手动分离单个细胞的方法，在二代测序的基础上进行了第1例单细胞RNA测序。大体来说，目前单细胞RNA测序的操作包含4个步骤：①单个细胞的分离、捕获；②反转录；③cDNA扩增；④测序文库的构建。通过给每个细胞加上独特的识别码，实现针对单个细胞进行测序，可以从根本上解决困扰研究者的异质性问题。结合生物信息学分析等研究方法，单细胞RNA测序为多个领域的研究带来新的契机。近年来，它被应用于发现新的细胞类群、动态观察发育过程、研究基因调控机制、观察随机等位基因表达等多个方面的研究[13]。且随着技术的进步，单细胞RNA测序逐渐从技术和价格上变得更加普及，研究者无需再过多关注测序方法，而可以将目光聚焦于生物学问题本身。本文将总结自单细胞RNA测序技术诞生以来在间充质干细胞研究中的应用，并展望其前景。

一、绘制细胞图谱、鉴定细胞亚群

单细胞RNA测序数据包含样本中每个细胞的转录组，可以用于了解样本中细胞的基本信息，如根据算法进行分群、鉴别不同亚群的标志物、研究差异表达基因的功能及通路等，并作为参照数据库，供之后的研究进行比对分析。Freeman等[14]于2015年对小鼠骨髓MSCs进行单细胞测序，发现多能性相关基因在骨髓MSCs单细胞之间的表达水平基本一致，但与成骨、成软骨、成脂、神经及血管平滑肌分化相关的基因表达水平却具有显著差异，免疫调节相关基因的表达也不一致。该研究证实了MSCs的谱系分化预备，也提示将MSCs应用于临床时应当谨慎小心——细胞间的异质性会导致治疗效果的不确定性。Liu等[15]2018年对来自3名供者的24358个离体培养的脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)进行单细胞RNA测序，建立了ADSCs的转录组数据集，这对于研究ADSCs的异质性和谱系分化预备均有重要参考价值，为后续研究奠定了基础。

二、观察MSCs的谱系层级

MSCs并不是单一、静止的干细胞群，而是分散于分化轨迹中不同位置的异质性细胞集群——从具有多能性的干细胞逐渐分化为组织细胞。Merrick等[16]通过对人类和小鼠脂肪间充质祖细胞进行单细胞RNA测序，发现群体中存在不同亚群，结合体内外功能试验，定义了间充质祖细胞的谱系层级：由二肽基肽酶-4 (DPP4) 标记的细胞是高度增殖的多能祖细胞，较不易分化为脂肪细胞；细胞间黏附分子-1(ICAM1)标记的细胞为脂肪前体细胞，轻微诱导即可分化为脂肪细胞；CD142+细胞与ICAM1+细胞相似。体内试验显示，DPP4+细胞首先分化为ICAM1+/CD142+的脂肪前体细胞，再分化为脂肪细胞。由于间充质祖细胞分化介导的增生性生长(脂肪生成)对于脂肪组织的正常功能至关重要，该过程缺陷会导致脂肪纤维化和炎症，进而导致胰岛素抵抗，因此，靶向上述分子促进间充质祖细胞向脂肪细胞分化或许能够改善代谢疾病。

Wolock等[17]对小鼠骨髓中的非造血细胞进行单细胞RNA测序，定义了非造血细胞的分群；结合计算模拟和细胞状态层级，可以绘制出从间充质细胞到骨、软骨和脂肪的分化轨迹，并确定各条轨迹中的关键转录因子。

三、细胞谱系之间的差异比较

比较不同来源、不同状态的MSCs，或将MSCs与其他细胞谱系比较，有助于深入理解细胞特性的差异及其背后的机制，例如根据治疗需要选择具有不同特性的细胞系，指导临床应用。Barrett等[18]通过单细胞RNA测序比较华通胶和骨髓来源的MSCs，发现436个差异表达基因参与免疫调节、血管生成、创伤愈合、凋亡、抗肿瘤活性和趋化作用等过程。其中，华通胶来源的MSCs中免疫分子的表达显著高于骨髓MSCs。Zhou等[19]比较了人脂肪和骨髓来源MSCs的单细胞测序资料，和两种细胞在临床应用上的特性。测序揭示了以下不同点：脂肪来源的MSCs比骨髓来源的MSCs异质性更低，更不依赖于线粒体呼吸产生能量，表达HLA-Ⅰ类抗原水平更低，免疫抑制作用更强。在治疗骨关节炎方面，脂肪来源的MSCs疗效更加稳定。Zhao等[20]比较了胚胎和成体骨髓MSCs，发现二者具有很大差异。通过分析差异表达基因，发现成体骨髓MSCs表现出更活跃的血管分化和细胞运动。由此可以推测，在血管相关领域，成体骨髓MSCs的应用潜力更大。

Sisakhtnezhad等[21]使用单细胞RNA测序比较小鼠精原干细胞与MSCs的差异表达基因和转录调节因子，以MSCs为对照，找到了精子发生过程、细胞类型转换中的重要因子。Xiao等[22]通过比较无菌小鼠和无特定病原体小鼠的骨髓MSCs，发现菌群对于干性的维持有重要作用；将无特定病原体小鼠的菌群移植给无菌小鼠，则其骨髓MSCs的增殖和分化能力恢复正常；菌群还通过诱导活化的T细胞凋亡和分泌细胞因子维持骨髓MSCs的免疫调节功能。

四、观察MSCs的组织分布与作用

越来越多的组织中发现了MSCs的存在。单细胞RNA测序可以发现组织中新的细胞类群，包括MSCs，并进一步分出亚群；通过生物信息学方法分析各亚群高表达基因参与的通路、生物学过程等，可以推测MSCs参与了哪些生物学过程及其机制。

Liu等[23]对妊娠早期和中期的人胎盘进行单细胞测序，发现其中除了已知的多种细胞及其新亚群，还有间充质基质细胞。Shafiee等[24]研究发现人类足月胎盘中存在中内皮双能祖细胞，在体外可分化为内皮组织和间充质组织，且向间充质分化的过程不受经典的内皮-间充质转化因子TGF-β通路的调控。Kameishi等[25]在角膜缘上皮组织中通过单细胞测序发现，至少有两群细胞的表型类似不成熟的上皮/间充质组织细胞，为传统认识的角膜上皮干细胞中新的亚群。有研究者对体外传代培养的人软骨细胞进行测序发现，绝大多数细胞具有间充质干细胞的标记，且能够被诱导分化为骨细胞和脂肪细胞，说明该细胞符合ISCT提出的鉴定标准，可以被称为间充质干细胞。

Gu等[26]对血管旁脂肪组织进行测序，发现其中存在间充质干细胞，且其中一个亚群表达与平滑肌分化相关的重要通路，这说明间充质干细胞可能通过分化为血管平滑肌细胞来维持血管的生理功能。对小鼠静脉移植模型进行MSCs移植，可以观察到MSCs通过平滑肌分化对血管重塑的作用，且分化过程受到TGF-β1和miR-378a-3p的调控。

牙泡中存在间充质祖细胞，它们参与形成根骨界面，并通过自分泌/旁分泌的甲状旁腺素相关肽(PTHrP)及其受体调节牙齿萌出的过程[27]。Takahashi等[27]通过单细胞测序发现，牙泡细胞中PTHrP+的亚群也表达高水平的PTH/PTHrP受体(PPR)，结合细胞谱系分析等方法，得出牙泡中的间充质祖细胞通过PTHrP及其受体的自分泌/旁分泌途径维持自身的生理功能和细胞命运的结论。

Kayaba等[28]通过共培养等试验发现骨髓中PDGFRα+Sca-1+间充质干细胞具有促进浆细胞存活并分泌抗体的作用，为推测其中可能的分子和通路进行单细胞RNA测序，发现PDGFRα+Sca-1+间充质干细胞具有异质性，其中一群细胞表达Vcam1、Nes和IL-6等与浆细胞和造血干细胞密切关联的基因，ELISA证实，PDGFRα+Sca-1+间充质干细胞可分泌IL-6。

五、观察MSCs的诱导分化过程

MSCs在合适的诱导条件下，可以分化为间充质以外的组织，是再生医学，尤其是组织工程中极具应用前景的种子细胞。Li等[29]从人脂肪组织中获取了一种新的MSCs，并将其诱导为有功能的肝细胞，使用单细胞RNA测序观察分化过程中基因表达谱的变化。不同于以往报道的MSCs，这种新的类群处于常染色质状态，具有表观遗传多能性，并表达多能性标志物MYC、KLF4和GMNN。基因本体分析显示，MSCs分化为肝细胞全程中的事件中，如KLF4和GMNN等多能性相关基因的表达水平逐渐降低直至消失，而血管生成、胶原纤维合成等基因的转录水平逐渐升高，肝脏发育的关键基因ATF5于诱导后3天开始表达。诱导后5～9天之间基因表达的变化最大，与肝细胞谱系特化有关；9～13天时，与肝细胞功能相关的基因，如脂质运输、维生素代谢、脂质合成、胆固醇调节等相关基因的表达开始上调。该研究将单细胞RNA测序应用于MSCs分化的过程中，揭示了细胞发育和转换中的变化和机制。

六、展 望

单细胞RNA测序技术的诞生与不断革新使得分析复杂样本中千万余单个的细胞成为可能。不断有更加灵敏、更加自动化的方法和技术产生，使研究者可以用更短时间获得更多更加精确的数据。单细胞RNA测序将精度提升，以生命活动的基本单位——细胞为单位来分析，可以避免单个细胞的特征被掩盖，观察到细胞与细胞、细胞与环境之间的复杂交流等多种重要的信息。该技术在多个领域的应用将产生一大批对未来具有极大影响的知识，如肿瘤、免疫、胚胎发育、再生医学等。在MSCs研究领域，单细胞RNA测序技术的应用可以解决异质性问题，将细胞群体进一步细分，分析不同来源、不同亚群MSCs的特点，寻找新的细胞标志物，针对不同患者、不同治疗需求选择不同细胞，助力再生医学、精准医学的发展；研究MSCs的组织分布、参与的生物学过程和机制可能促进对干细胞生理功能与不同条件下作用的理解，并找出可能有效的干预靶点，为疾病的治疗方法提出新的假设；MSCs作为再生医学中极具潜力的种子细胞，通过单细胞RNA测序观察其诱导分化过程可以为新的治疗手段打下理论基础。

展望未来，单细胞RNA测序技术必然在精度和成本上有进一步的提升，其普及将为自然科学研究带来新的飞跃。