热休克蛋白47与哺乳动物生殖

高辉，王艺琛，张昌军，刁红录，4*

(1.十堰市人民医院(湖北医药学院附属人民医院)生殖医学中心，十堰 442000；2.湖北医药学院生物医药研究院，十堰 442000；3.湖北省生殖医学临床医学研究中心，十堰 442000；4.湖北医药学院生物医学工程学院，十堰 442000)

一、概述

胶原蛋白是动物体内最丰富的结构蛋白，由28个已知成员组成。作为细胞外基质的主要成分，通过形成纤维或者网状结构存在动物体的各个组织之中。此外，胶原蛋白与细胞表面受体、基质金属蛋白酶等多种蛋白相互作用，参与细胞粘附、增殖、细胞外基质调控等过程，对于维持生物体的结构和功能的完整性具有十分重要的意义[1]。热休克蛋白47(Heat shock protein 47，HSP47)是定位在内质网上参与胶原蛋白生物合成过程的一个重要的分子伴侣，可与三螺旋胶原蛋白短暂而专一的结合，以稳定其构象促进其成熟；由SERPINH1基因编码，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine proteinase inhibitors，Serpin)超家族，具有与Serpin相同的分子折叠构象，但并不具有丝氨酸蛋白酶抑制活性[2]。

1.HSP47与胶原蛋白成熟：胶原蛋白是由三个肽链组成的右手三螺旋结构，肽链采用左旋聚脯氨酸Ⅱ型构象，并通过链间氢键连接在一起，是由三个超过300不间断的重复Gly-Xaa-Yaa三联体的α-肽链构成[1]。目前对于HSP47作为胶原蛋白特异性分子伴侣的功能主要存在两种假说：一种是通过稳定热不稳定的三螺旋折叠中间体来促进前胶原蛋白的折叠，另一种是抑制前胶原蛋白在内质网中的聚集或侧联[3]。HSP47和胶原蛋白的结合与pH值、重力、特异性氨基酸序列等因素相关。

HSP47是哺乳动物细胞内质网中唯一的热诱导伴侣蛋白。热休克时，热休克因子1与位于HSP47转录起始位点180 bp处的热休克元件结合，激活HSP47 mRNA的转录[4]。Hsp47基因敲除的小鼠胚胎中建立的成纤维细胞在37℃培养时，细胞内的前胶原蛋白的生物合成出现各种缺陷。降低培养温度如33℃，胶原蛋白合成恢复正常。说明了HSP47可以稳定热不稳定的三重螺旋折叠中间体来促进前胶原蛋白的折叠[3]。

当pH值呈中性条件下，HSP47和内质网上的前胶原蛋白短暂的结合，在顺式高尔基体或内质网-高尔基体中间间隔室中，pH值变成酸性，HSP47和前胶原蛋白分离，然后通过HSP47的RDEL保留序列被运输回内质网内，HSP47的组氨酸残基参与了这种pH值依赖性释放机制[5]。三螺旋前胶原分子与HSP47一起通过大被膜蛋白复合物II(Coat protein complex II，COPII)从内质网运输到高尔基体，其中TANGO1参与了复合物的形成[6]。HSP47与ER中的三螺旋前胶原内的胶原(Gly-Xaa-Arg)重复序列结合，并且可以防止其局部解折叠或聚集体形成，从而加速前胶原的三螺旋形成，这种抑制也具有pH值依赖性[7]。HSP47和胶原蛋白之间的相互作用是由胶原蛋白Gly-Xaa-Arg-Gly基序中的Arg残基和HSP47保守的Asp385残基之间形成的一个关键盐桥所建立的[8]。HSP47 mRNA的表达与重力的变化具有相关性[9]。缺乏HSP47的细胞，胶原蛋白分泌速率慢，且较容易被蛋白酶消化[10]。

2.HSP47与内质网应激和高尔基体应激：内质网相关降解(ER-associated degradation，ERAD)和未折叠蛋白反应(Unfolded protein response，UPR)是细胞内两个关键的质量控制机制[11]。持续的内质网应激状态常导致细胞凋亡。HSP47通过与免疫球蛋白结合蛋白竞争和肌醇酶1α的结合促进肌醇酶1α的激活从而减小内质网应激的发生[12-13]。在缺乏HSP47的细胞中积聚在内质网的错误折叠的前胶原蛋白会被自噬系统所清除[14]。

蛋白质分泌大量增加可导致高尔基体功能不足，会激活高尔基体应激反应。HSP47保护高尔基体免受O-糖基化抑制的影响，而抑制O-糖基化来干扰糖蛋白转运是激活高尔基体应激反应的有效刺激因素[15]。在HSP47敲除的细胞中诱导高尔基体应激的发生会导致细胞死亡，同时高尔基保留型凋亡蛋白酶-2的裂解增加和线粒体凋亡蛋白酶-9的激活，以及高尔基反应的诱导也会引起UPR反应[15-17]。

3.HSP47组织特异性表达：HSP47和Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白之间具有时间和空间的相关性，仅在产生胶原蛋白的组织细胞中表达，在不生产胶原蛋白细胞中不表达，HSP47的表达的上升或者下调总是伴随着各种类型胶原蛋白表达变化而改变[14，18]。HSP47还可与修饰蛋白、纤维调节蛋白和层粘连蛋白结合构成细胞外基质，并参与其分泌[19]。目前鉴定出的HSP47的13个最常见错义突变为Ser76Trp、Arg103Cys、Arg116Cys、Ser159Phe、Arg167Cys、Arg280Cys、Trp293Cys、Gly323Trp、Arg339Cys、Arg373Cys、Arg377Cys、Ser399Phe和Arg405Cys，其中以精氨酸和半胱氨酸变化为主。这些发现将有助于评估HSP47在胶原蛋白错误折叠和人类疾病中的作用[20]。光激活的HSP47在病变状态细胞中，可根据需要促进胶原合成，并具有时空分辨率，可以为组织再生等领域提供新的治疗思路[21]。

综上所述，HSP47通过增加前胶原蛋白三螺旋结构的稳定性从而促进胶原蛋白的成熟，其与胶原蛋白的结合还与pH值、重力、特异性氨基酸序列等因素相关。在生物体内HSP47可以减小内质网应激和高尔基体应激给细胞带来的损伤。HSP47的表达具有组织特异性，只在表达胶原蛋白的组织或细胞中表达。目前研究发现HSP47对于哺乳动物生殖的胚胎发育、器官分化、性腺和胎膜正常功能以及生殖系统肿瘤等方面都密切相关，下文将逐一介绍。

二、HSP47与哺乳动物生殖

哺乳动物生殖包括配子成熟、受精卵结合后在母体子宫发育成胎儿并从母体分娩的连续复杂的动态生物学过程。任何一个环节都与胶原蛋白正确的生物学结构和功能息息相关，HSP47的表达异常会造成胶原蛋白的结构缺陷和稳定性受损，从而影响哺乳动物生殖过程的正常进行，造成胚胎发育、细胞分化、性腺和胎膜正常功能等方面的异常。因此HSP47正常有序的表达对于哺乳动物生殖具有至关重要的作用。

1.HSP47与胚胎发育：胚胎发育是指从受精卵分裂分化发育为完整个体的生物学过程，HSP47在早期胚胎的发育过程有重要作用。Hsp47基因敲除小鼠的胚胎存活不超过交配后(Days postcoitum，dpc)11.5天，在9.5 dpc可观察到胚胎基底膜发生间断性的断裂，内脏内胚层的细胞形态紊乱以及基底膜的主要成分Ⅳ型胶原的含量也明显减少，电镜显示Ⅳ型胶原积聚在扩张的内质网中；在10.5 dpc胚胎体型比野生型要小，体节细胞的数量较野生型少，同时几乎无法检测到Ⅰ型胶原蛋白的表达；在10.5～11.5 dpc的胚胎几乎检测不到Ⅳ型胶原蛋白和αα链的存在，虽然在有的胚胎中存在基底膜样的结构，但是它们的超微结构异常[7，10]。HSP47的缺失导致胶原蛋白合成发生异常，折叠错误的胶原蛋白在内质网中的积累引起的内质网应激，上调调亡标志物CHOP的表达诱导胚胎发生细胞凋亡，是Hsp47基因敲除小鼠胚胎的死亡的重要原因之一[22]。综上所述，HSP47对于小鼠胚胎的基底膜的正常结构、内脏内胚层的正常形态的维持至关重要。

Masuda等[23]通过免疫组化来检测HSP47在小鼠胚胎发育过程中的表达，发现HSP47在小鼠胚胎发育分化阶段的表达开始于7.5 dpc，主要表达在中胚层和来自中胚层的组织如连接组织、软骨、脊索、体节等，在神经脊间质(发育板、喉、面部中胚层)、中枢神经系统发育过程中的一些细胞增殖区域(如脉络膜丛、神经管的腹侧)、外胚层的脑室的腹侧、室管膜细胞、胃肠道上皮、肝实质细胞下的间叶组织、心脏的肉垫组织以及心内膜组织也可以检测到HSP47的表达。HSP47对于软骨发育和正常的软骨内骨形成是必不可少的。利用Hsp47-flox小鼠和携带软骨细胞特异性Col2a1-Cre转基因小鼠杂交，在软骨细胞中条件性地敲除Hsp47基因，小鼠在出生前或出生后不久死亡，并表现出严重的广泛性软骨发育不良和骨骼畸形，骨骼染色显示骶骨椎体未见钙化区，软骨内骨严重扭曲和缩短，Ⅱ型和Ⅺ型胶原水平较低，Ⅰ型胶原分子在椎间盘中堆积错位，Ⅱ型胶原纤维大量减少[24]。在胰岛素样生长因子II mRNA结合蛋白1(IMP1)基因敲除的小鼠表现出肠绒毛小而畸形和结肠隐窝扭曲，同时HSP47表达下降，表明IMP1与HSP47可能通过调控细胞外基质的形成促进小鼠胚胎发育过程中肠道形态的形成[25]。HSP47在胚胎发育早期的眼组织中强烈表达，分布在间充质细胞(角膜基质、巩膜和脉络膜)和透明血管中，在眼发育过程中表达下调，直到产后14 d[26]。综上所述，HSP47在小鼠胚胎发育早期表达，主要表达在中胚层、神经脊间质、外胚层的脑室的腹侧等组织，在软骨、肠道、眼等器官发生过程中，HSP47也起到重要的生物学作用。

2.HSP47与细胞分化：HSP47在胚胎干细胞(Embryonic stem cells，EMS)向血管平滑肌细胞(Smooth muscle cells，SMC)分化的过程中高度表达，HSP47的缺失会导致分化的减弱。在没有外源性刺激的情况下，HSP47的过表达也可以诱导ESC向SMC的分化，可能是通过上调趋化因子受体来实现的[27]。目前认为HSP47不直接作用于趋化因子，但HSP47是Ⅰ型和Ⅳ型胶原蛋白成熟的分子伴侣，Ⅰ型和Ⅳ型胶原蛋白可以通过整合素(α1/β1/αV)信号转导来诱导ESC的SMC分化[28]，所以HSP47可能是通过增加胶原蛋白的产生和分泌而促进ESC的SMC分化[27]。非钙依赖性的多功能蛋白S100A4和HSP47结合可以改变HSP47与胶原蛋白结合的氨基酸的电荷，与HSP47竞争和胶原蛋白的结合，诱导细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)和基底膜的重塑，进一步改善细胞分化的微环境，从而调节骨膜细胞的分化[29]。综上所述，HSP47具有促进细胞分化的作用，可以促进EMS向SMC的分化，以及与S100A4结合调节骨膜细胞分化的过程。因此进一步研究HSP47在细胞分化方面的功能，对于操纵干细胞向目标组织细胞的分化具有重要的意义，为干细胞治疗提供新的思路。

3.HSP47与性腺功能：性腺是产生配子的地方，同时也是重要的内分泌器官。在小鼠性腺发育的过程中，HSP47具有十分重要的意义。在睾丸和卵巢中HSP47和XXVI型胶原具有相互作用关系[30]：XXVI型胶原在出生第1天小鼠睾丸中表达较高，之后逐渐减少，在第5天时发现只表达在肌样细胞；在睾丸间质细胞、睾丸支持细胞以及精原细胞都没有表达；XXVI型胶原在出生2周以内的小鼠的卵巢中表达较高，之后也逐渐减少；在第7天的小鼠卵巢中，XXVI型胶原表达在初级卵泡周围的前卵泡膜细胞以及卵巢髓质和皮质的细胞外基质区域，但初级卵泡细胞中没有表达。目前关于HSP47与XXVI型胶原相互作用机制以及HSP47在睾丸和卵巢的发育过程中的具体作用还需要进一步研究。

《国家中长期教育改革和发展规划纲要（2010—2020年）》明确指出：“信息技术对教育发展具有革命性影响，必须予以高度重视。”这充分说明教育信息化对现代教育的重要意义。很多一线教师给予信息技术高度关注，肯定了信息技术带给教学的诸多便利。但是通过访谈和实地调研发现，有些教师在观念上存在问题，习惯于使用传统的教学方式进行教学；部分教师认为能熟练操作一些基本软件、能从网上下载需要的教学资源，就是拥有信息技术教学能力。现在很多学校信息化教学设备资源得到快速发展，但由于教师的应用能力明显滞后于软硬件的发展，导致信息技术应用效果没有达到预期目的。是否还有其他因素在影响教师应用信息技术辅助教学，值得研究。

在甲状腺功能减退的卵巢中，HSP47表达增加，I和Ⅲ型前胶原蛋白的表达也增加，可以弥补卵巢组织因甲状腺功能减退(甲减)所造成的ECM的降解，代偿甲减所带来的卵巢功能的损伤[31]。糖尿病患者常出现男性勃起功能障碍。链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型与正常大鼠相比，HSP47在糖尿病模型大鼠的阴茎表达显著降低，表明HSP47可能在糖尿病男性患者勃起障碍中发挥重要作用[32]。

综上所述，HSP47在睾丸和卵巢的发育过程中均表达，但其具体作用机制需进一步研究。在临床中，HSP47在甲减患者的卵巢中表达增高，其具有一定代偿作用。糖尿病患者阴茎组织中HSP47表达降低，表明HSP47与其勃起障碍具有一定的关系。

4.HSP47与胎膜功能：胎膜是胚胎生长发育必不可少的辅助器官。在妊娠早期，胚胎悬浮于子宫腔内，当其发育至胚泡阶段开始伸展，在此期间，胎膜开始形成并向外生长。胎膜起着保护胎儿并从母体获取营养物质、排出废物和提供水环境的作用。有研究发现，在非洲人和非裔美国人中携带有HSP47的656小T等位基因的频率高于欧洲裔美国人，其携带者易在妊娠期出现早产胎膜破裂(Preterm premature rupture of membranes，PPROM)；PPROM的胎膜胶原蛋白和HSP47表达都降低，这与HSP47的656等位基因有关[33-34]。HSP47基因启动子中的SNP区域可以降低细胞的启动子功能，与HSP47的主要656 C等位基因相比，656 T等位基因具有较低的启动子活性[35]。携带HSP47 656 T等位基因的羊膜细胞中的HSP47表达减少，从而减少间质中胶原蛋白合成，使得羊膜的拉伸程度减弱。而羊膜成纤维细胞中HSP47的主要656 C等位基因会使纤维胶原聚集从而使得羊膜具有较大的拉伸强度[33-34]。有研究发现当在HSP47启动子区的12-bp片段出现缺失时，这会增加启动子活性，并且能减轻656 T等位基因对PPROM的影响[36]。

子宫肌层ECM重组对于分娩时同步宫缩，胎膜正常功能和宫颈成熟十分重要。肥胖的产妇瘦素水平升高，抑制脂多糖诱导的肌层ECM重塑的能力，与HSP47表达的增加以及基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase，MMP2)和MMP9活性和表达的降低有关[37]。

综上所述，携带HSP47 656C等位基因的孕妇其胎膜具有更强的拉伸力度，而656T等位基因具有较低的启动子活性，其胎膜拉伸强度较低更容易发生PPROM，但是HSP47启动子区的12-bp片段出现缺失能减轻656T等位基因对PPROM的影响。肥胖孕妇体内瘦素水平较高，HSP47表达增强，其子宫肌层重塑能力减弱，具有较高的分娩风险。

三、HSP47和女性生殖系统肿瘤

HSP47蛋白由SERPINH1基因编码，该基因位于染色体11q13.5上，该基因是人类癌症中最频繁扩增的区域之一[14]。miRNAs(microRNAs)是一大类长度为19～23 bp非编码的单链RNA，这些单链miRNA结合目标基因3′非翻译区UTR上的互补位点，使得mRNA降解和翻译抑制调节转录后基因表达，从而参与生物过程，包括细胞分化、增殖、凋亡和转移[38]。HSP47在宫颈癌肿瘤组织和宫颈上皮内瘤变中表达上调；在宫颈癌中，miR29与HSP47的表达具有相关性，miR-29抑制HSP47的表达，miR-29的下调导致HSP47的上调。miR-29可以诱导宫颈鳞状癌细胞凋亡，抑制宫颈癌癌细胞的增殖和侵袭[39]。

综上所述，miR29与HSP47的表达具有相关性，在宫颈癌中HSP47表达上调，但miR-29可以诱导宫颈鳞状癌细胞凋亡，抑制宫颈癌癌细胞的增殖和侵袭。在乳腺癌中HSP47的表达增加以及miR-29b和-29c表达降低，HSP47受TGF-β通路的调控，HSP47与DDR2、NMIIA的相互作用会增强癌细胞的迁移和侵袭。

四、结语

优生优育是目前国家重点规划之一，健康宝宝的出生不仅需要良好的胚胎，更需要一个健康的母体为其提供好的“土壤”。HSP47是丝氨酸蛋白酶抑制剂中一个重要的热休克蛋白，它对胶原蛋白的成熟有着十分重要的意义。目前研究发现HSP47在胚胎发育、器官发生、细胞分化、性腺和胎膜的正常功能以及女性生殖系统肿瘤中有着不可或缺的作用。进一步研究HSP47在哺乳动物生殖过程中的调控作用，将对阐明不孕不育的病因、胚胎发育异常的分子基础有重要意义。同时，对提高辅助生殖技术的体外胚胎培养的胚胎生存率和优生优育都具有重要意义。