宏基因组学二代测序在免疫功能受损不明原因肺部感染患者病原鉴别中的意义*

张 弦 ，顾宇峰 ，赵 华 ，周 跃 ，金爱萍 ，张 彬 ，张海峰

（南通大学附属医院1 感染性疾病科；2 影像中心，江苏226001）

近年来随着器官移植、骨髓移植的不断开展, 以及恶性肿瘤的化放疗、风湿免疫性疾病免疫抑制治疗、血液病诊治逐渐增多，免疫功能低下合并肺部感染患者逐年增加，也使得免疫功能受损肺部感染患者的病原体更为复杂和多样[1]。在免疫功能受损人群肺部感染发生率较免疫功能正常患者更高，可高达70% 以上，普遍存在下呼吸道难以直接采集标本、检测标本留取不合格、病原体诊断困难、多而复杂等问题。治疗因病原体不能明确，多限于经验性抗感染治疗不能精准施治。因此，准确、早期明确病原体并进行针对性抗感染治疗对这类患者预后至关重要。针对今年新冠病毒肺炎可疑病人排查过程的特殊性，对我院2020 年1 月—4 月收治不明原因肺部感染患者20 例加以回顾性分析，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 不明原因肺部感染患者20 例，其中男性 8 例，女性 12 例；年龄 17～82 岁，平均 56.30±16.91 岁。纳入标准：（1）入院时查血常规白细胞总数正常或降低，胸部CT 示肺部外带新发磨玻璃样结节或炎症渗出斑片影；（2）入院后查T 淋巴细胞亚群，示 CD4+T 淋巴细胞降低；（3）入院后间隔24 小时取两次咽拭子送新冠病毒（SARS-CoV-2）核酸检测阴性；（4）入院后系统排查未能明确肺部感染病原体者。系统筛查包括血、尿、大便三大常规，大便隐血试验，肝、肾功能，电解质，血糖，血、尿、痰培养，甲型流感、乙型流感、呼吸道7 种病毒检测、支原体、巨细胞病毒、EB 病毒等。所有患者入院检查血常规：白细胞总数多正常或降低，（6.65±3.40）×109/L；除 1 例淋巴瘤、粒细胞缺乏检出屎肠球菌患者降钙素原（PCT）高达 20.61 ng/mL，HS-CRP 262 mg/L；其余患者 PCT 低于 0.5 ng/mL (0.31±0.35 ng/mL)、HS-CRP小于 100 mg/L（68.69±69.85 mg/L）。CD4+淋巴细胞均低于 400/μL（259.58±118.87/μL）。

1.2 标本留取 于入院当日及24 小时后检测两次新冠病毒核酸阴性初步排除新冠病毒肺炎后外送病原mNGS 检测：根据患者临床表现以及实验室筛查结果，经医患充分沟通，患方签署针对mNGS 高额费用知情同意书及采信院外检查结果知情同意书。发热时，留取可疑部位血液、尿、痰或肺泡灌洗液、胸水、脑脊液等标本，一份送本院微生物室作细菌培养，另留一份mNGS 标本外送华大基因检测公司作病原学检测。mNGS 标本的采集、保存和运输严格按照该公司标准化规范执行。

1.3 病原学mNGS 检测

1.3.1 标本处理和DNA 提取：血液标本离心后取300 μL 血浆，痰液或肺泡灌洗液经玻璃珠混合震荡后取0.5～3 mL，脑脊液取300 μL。使用TIANamp Micro DNA Kit（DP316，TIANGEN BIOTECH，Beijing,China），根据试剂盒说明书提取DNA（用作DNA 文库构建），应用超声破碎至200～300 bp 的片段备用。

1.3.2 文库构建和测序、数据分析：使用Agilent 2100 Bioanalyzer 质控文库、Qubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.）质控 DNA 文库，文库经环化后再滚环复制（RCA）形成DNB 纳米球，然后加载至测序芯片，应用BGISEQ-500 进行高通量mNGS 测序。测序所得原始结果中去除质量低的数据，通过所得高质量数据中比对BWA：（http://biobwa.sourceforge.net/）去除人参考基因组序列和低复杂度结果（Reads），最后参照微生物大数据库，将比对后的数据按照细菌、直菌、病毒、寄生虫、支原体/衣原体等分类罗列形成初步实验室报告。对于与细菌培养结果明显不符、高度怀疑的病原学mNGS 结果，采用PCR 扩增/Sanger 测序验证。

1.4 临床解读 临床医生根据患者病情进展、影像学检查、本院病原微生物流行病学史、前期经验性抗菌药物疗效以及既往诊疗经验，全面分析传统细菌直菌培养、各种血清学病原检测报告、mNGS 病原检测报告，区分非无菌部位定植与感染，去除mNGS 背景病原检测假阳性结果，确定免疫力受损肺部感染患者相关致病病原体。

1.5 统计学处理 使用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析处理。病原mNGS 与传统培养结果比较采用配对χ2检验，两种方法诊断结果的一致性采用Kappa 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病原体检测阳性结果 20 例共送检23 份标本检测病原mNGS，血、胸水等无菌标本病原mNGS 共15 例，结果4 例血标本未检测到任何病原体，其余11 例共报告细菌7 种7 例次，其中口腔消化链球菌、衣氏放线菌、铜绿假单胞菌、卟啉单胞菌、伊氏李斯特菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌各1 例次；病毒3种4 例，其中单纯疱疹病毒-1、巨细胞病毒各1 例次、EB 病毒2 例次；直菌3 种7 例次，其中烟曲霉2例次、耶氏肺孢子菌4 例次。咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等非无菌标本病原mNGS 检测共8 例均有阳性病原体报告，检出的病原体数量和种类明显多于无菌标本，其中细菌7 种11 例次，其中屎肠球菌、肺炎链球菌、星座链球菌、结核分枝杆菌复合群、格雷文尼放线菌各1 例次、牙齿放线菌2 例次、副流感嗜血杆菌4 例次；病毒2 种3 例次，其中巨细胞病毒1 例次、EB 病毒2 例次；直菌4 种6 例次，其中烟曲霉菌、耶氏肺孢子菌、近平滑念珠菌各1 例次、白色念珠菌3 例次、支原体1 种1 例次，为口腔支原体。而传统细菌直菌培养仅两例报告了白色念珠菌，其病原mNGS检测中亦报告了白色念珠菌，未见其他病原体阳性报告。病原mNGS 检测2 例淋巴瘤患者1 例痰标本、1 例肺泡灌洗液，均有5 种病原微生物报告。

2.2 病原mNGS 与传统培养检测细菌、真菌阳性结果比较 传统细菌直菌培养仅检出2 例白色念珠菌，而病原mNGS 检测共检出19 例细菌直菌（含结核分枝杆菌1 例）；相比之下，病原mNGS 在23 份标本中鉴定出39 个病原体，多为培养不易获得的细菌、直菌。病原mNGS 检测阳性率82.61%（19/23），高于传统培养阳性率8.7%（2/23），差异有统计学意义（P＜0.001）。Kappa 一致性检验表明，病原 mNGS与传统培养诊断结果一致性较差（Kappa＜0.4）。另外，病原mNGS 还检测出单纯疱疹病毒-1、巨细胞病毒、EB 病毒、支原体共 8 例。

3 讨 论

由于新的抗菌药物和抗逆转录病毒药物等抗微生物药物广泛应用，免疫功能受损患者尽管对各种机会感染的易感性增加，但预后较前有所改善，肺部感染仍是这类患者常见感染，且其病原学确诊一直困扰临床医生[2]。传统检测感染病原体主要依靠可疑部位标本培养以及分子生物学诊断技术，微生物培养目前仍是感染病原诊断的金标准，但其存在耗时长、不同病原体需不同培养基、阳性率过低等缺陷。分子生物学诊断方法，如酶联免疫吸附（ELISA）原位杂交、聚合酶链式反应（PCR）、一代桑格测序均依赖于病原体核酸的已知序列[3]，每次检测仅识别有限甚至特定的病原体种类。这对免疫功能受损肺部感染患者病原学识别存在明显不足，因为免疫功能低下患者肺部感染通常同时发生多种条件致病感染性疾病，如常见耶氏肺孢子菌（PCP）同时合并巨细胞病毒（CMV）的感染，亦可于病程中序贯出现不同病原体感染，如病毒感染后继发直菌或细菌感染。本研究发现，20 例CD4+T 淋巴细胞减少免疫功能受损肺部感染患者传统细菌直菌培养仅2 例报告了白色念珠菌，阳性率不高8.7%（2/23），未见其他病原体阳性报告，而病原mNGS 检测阳性结果明显高于传统方法，且同期同类标本中亦检测出白色念珠菌。

与传统培养相比，病原mNGS 检测由于其独特的机制，具有更广的微生物检出谱，作为近年来更敏感的理想感染病原学检测方法，正成为新的研究热点；其对病原微生物几乎达到“一网打尽”效果，能同时一次性敏感识别不同类病原体[4]，尤其在细菌感染合并直菌、病毒、支原体、衣原体或原虫等感染时更具显著意义。一份合格的病原mNGS 检测报告，需从规范取样开始，经严格的质控:去除人源化基因组成成份、数据过滤、与病原数据库中的参考序列进行比对；结合患者相关临床信息，排除疑似背景微生物才最终形成包括检测病原微生物列表、检出病原序列数量、所检测病原范围、检测方法及检测技术说明的实验室报告[5]；正式病原微生物报告为符合病原mNGS判读标准的所有病原微生物，如检出的疑似病原微生物——细菌、病毒、直菌和寄生虫，并于附录中列出背景微生物[6]。本研究结果显示，病原mNGS 在23份标本中实验室鉴定出39 个病原体，多为培养不易获得的细菌、直菌；根据患者临床表现、血常规、PCT、hCRP、前期经验性治疗效果，最终判定细菌直菌病原mNGS 结果共19 例细菌直菌（含结核分枝杆菌1 例），阳性率达到82.61%（19/23）；另外在不易由培养获得的寡养细菌、直菌、病毒、支原体等少见病原体，病原mNGS 检测存在明显优势，本研究中还检测出单纯疱疹病毒-1、巨细胞病毒、EB 病毒、支原体共8 例。目前病原mNGS 检测较传统培养在排查致病病原微生物方面优势已获得多数专家的认可：病原mNGS 检测报告中微生物检出序列数异常升高，在排除背景菌、污染菌和定植菌的情况下，可结合临床判定该微生物为致病病原体；胞内菌如布鲁菌、结核分枝杆菌等因释放到体液中含量较少、直菌等厚壁的病原微生物核酸提取率较低，均可降低检出率致敏感性下降，所以对胞内菌和厚壁微生物如直菌mNGS 检出阳性率低，即使报告中序列数或丰度不高，结合临床排除定植后，仍判定为感染致病病原[6]；综上不难发现病原mNGS 检测尤其在结核、厌氧菌、直菌和病毒等诊断方面优势明显，且文献报告采样前使用抗菌药物对mNGS 的影响明显小于传统培养[7]。另有研究[8]发现存在免疫功能抑制患者感染病原体筛查中，在病毒和细菌诊断方面病原mNGS 检测阳性率明显高于传统培养，同时病原mNGS 检测结果的阴性预测意义更大。但是病原mNGS 如此高的敏感性，也为临床判断致病病原带来麻烦[2，7]，本研究中2 例淋巴瘤患者（CD4+淋巴细胞均低于200/μL）1 例痰标本、1 例肺泡灌洗液，均有五种病原微生物报告。因病原mNGS 技术层面不足，难以形成统一量化的判定标准，一般检测机构不作致病微生物结果判定，仅尽可能提供详细检测结果列表（阳性结果的实验室报告），最终交由经验丰富的临床医生根据留取标本类型、排除背景微生物、结合患者的临床表现、传统的病原培养、血清学检测报告和影像等辅助检查，评判定植、背景还是致病微生物[6]。

本研究发现，无菌标本如血液、胸水等病原mNGS 检测结果中4 例血液标本未检测到任何病原体；而非无菌标本如咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等病原mNGS 检测共8 例均有阳性病原体报告，且检出的病原体数量和种类明显多于无菌标本。究其原因，本组病例均为肺部感染，与感染部位相关的呼吸道分泌物病原体检测阳性结果应高于血液等无菌标本，再者因免疫力受损患者各种条件致病机会感染增多，多数常规培养不易获得的寡养细菌、直菌、病毒等能由病原mNGS 检测从呼吸道标本中检出[9-10]；另外在留取标本前，患者在当地医院因怀疑细菌、直菌感染，已经验性使用抗菌药物，导致无菌标本病原微生物不易培养；传统培养仅能检测到一种优势病原体，而其他合并感染的病原体可能被抑制而无法检出，而mNGS 可检出更微量的病原体核酸，具有更高的敏感性、病原体检出更全面。

本文病原mNGS 检测阳性率82.61%（19/23）远高于传统培养阳性率8.7%（2/23），由于收集病例数偏少，难免存在偏差，有待扩大检测例数来验证；本组病例为SARS-CoV-2 疫情期间住院患者，入院常规两次SARS-CoV-2 核酸检测阴性后，再留取相关标本外送，对病情与检查结果可能存在一定影响。感染病原mNGS 检测自身存在检测技术要求高、假阳性结果、RNA 病毒易降解、仪器设备昂贵等不足之处，难以在各家医院普及[6]，多数医院需外送标本定点检测。随着公司布点增多、技术进步，缩短检测周期和降低检测费用，病原mNGS 检测在临床上可更好地服务于患者。