新型冠状病毒实验室特异性检测技术研究进展*

毛佳泉 综述，鲁 彦，寇 炜▲ 审校

1.西北民族大学医学部，甘肃兰州 730030；2.中国人民解放军96604部队医院检验科，甘肃兰州 730030

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的急性呼吸道传染病，以发热、干咳、乏力为主要表现。SARS-CoV-2主要经呼吸道飞沫和密切接触传播，潜伏期1～14 d，人群普遍易感[1-4]。流行病学接触史、临床症状、肺部影像学特征性改变、实验室实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测患者呼吸道分泌物等标本中SARS-CoV-2核酸是临床诊断COVID-19的主要依据[5-8]。COVID-19尚无特效治疗药物，因此早发现、早诊断、早隔离、早治疗是现阶段疫情防控的关键。通过基因测序、实时荧光定量RT-PCR、环介导等温扩增或基因芯片检测病毒核酸，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金免疫层析法(GICA)、化学发光免疫分析技术(CLIA)检测抗体是目前检测SARS-CoV-2感染的主要方法。本文通过对SARS-CoV-2实验室特异性检测技术进行综述，以期为临床医生及科研工作者提供更好地防治策略和研究思路。

1 病毒分离培养与鉴定

培养和鉴定SARS-CoV-2是诊断COVID-19感染的金标准。ZHU等[9]将4例确诊患者的肺泡灌洗液(BALF)接种于人呼吸道上皮细胞(HAE)，经过3次传代后，收集已出现细胞病变的HAE上清液，通过透射电镜观察和实时荧光定量RT-PCR技术进行检测，同时利用HAE、Vero E6和Huh-7细胞系分离病毒，以及无偏倚高通量全基因组测序发现了SARS-CoV-2。ZHOU等[10]将SARS-CoV-2 PCR检测结果为阳性的ICU患者BALF标本离心、过滤、DMEM稀释后接种到Vero、Vero E6和Huh7细胞系中，37 ℃孵育，其中Vero E6细胞在48 h后被感染，感染复数为0.5。ZHOU等[10]通过透射电镜、中和试验和实时荧光定量RT-PCR技术、无偏倚高通量全基因组测序证实该病毒为SARS-CoV-2。病毒的分离培养鉴定虽然是病原学诊断的金标准，但操作技术难度大，对实验室级别要求高，不符合现阶段SARS-CoV-2检测需求。

2 核酸检测

2.1基因测序 应用Illumina和nanopore公司设备和试剂对3例患者BALF标本和HAE病毒分离株基因组测序，获得2个近全长冠状病毒序列和1个全长冠状病毒序列，结果提示SARS-CoV-2序列与蝙蝠严重急性呼吸综合征(SARS)样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45，MG772933.1)基因组有86.9%的核苷酸序列同源性[9]。有研究者从2例患者BALF标本中提取RNA通过宏基因组测序(mNGS)，即从所得的测序数据中删除包含有衔接子序列和低复杂区域的读段并参照人类基因组图谱删除人类的读段，将所有非人类和非重复序列的读段分别与参照的病毒数据库和非冗余蛋白质数据库进行对比测序，结果表明mNGS能够快速检出标本中具有唯一高丰度的病原体[11]。WANG等[12]结合目标扩增、长读和实时纳米孔测序的优点首创纳米孔靶向测序(NTS)方法，该方法灵敏度远高于实时荧光定量RT-PCR，能在6～10 h内检测出SARS-CoV-2和呼吸道合胞病毒、腺病毒等其他常见的呼吸道病毒，有利于快速判断COVID-19患者是否存在其他呼吸道病毒感染，对控制交叉感染和临床指导用药具有重大意义。基因测序技术具有灵敏度高等优势，有利于科研工作者及时发现病毒核酸是否发生变异，为临床诊治提供指导。

2.2实时荧光定量RT-PCR技术 实时荧光定量RT-PCR技术是目前临床实验室检测核酸的主要方法。该检测技术根据SARS-CoV-2的RNA序列通过逆转录酶合成cDNA链，在人工设计的特异性引物下对核酸片段进行扩增，扩增完毕的核酸片段与Taqman 探针特异性结合形成靶标基因片段后在Taq 酶的5′～3′核酸外切酶活性作用下水解，Taqman 探针的荧光基团远离淬灭基团，最终靶标基因片段发出荧光信号，根据荧光信号阈值测定所需循环数(Ct值)[13-14]。实时荧光定量RT-PCR技术检测SARS-CoV-2主要靶向SARS-CoV-2基因组中的开放读码框lab(ORF1ab)基因和核壳蛋白N[15]。CHU等[16]根据SARS-CoV-2基因组中ORF1ab区和N区开发了2种单步实时荧光定量RT-PCR检测方法，结果表明N区的测定灵敏度是ORF1ab区的10倍，推测采集的临床标本中表达亚基因组的mRNA病毒感染了部分细胞导致标本中含有大量的N基因拷贝，使得N区的测定灵敏度高于ORF1ab区。CHU等[16]建议将N区作为初筛测定，ORF1ab区的作为确诊测定。CORMAN等[17]在缺乏SARS-CoV-2病毒分离株的条件下，根据SARS-CoV-2与SARS冠状病毒的密切遗传相关性，以及Genbank数据库中获得的部分或完整的SARS-CoV-2序列，人工合成特异性引物，通过实时荧光定量RT-PCR技术检测SARS-CoV-2基因组内的E、N、RdRP基因，结果表明RdRP基因测定灵敏度最高，E基因次之，N基因稍低。此外，CORMAN等[17]设计的特异性RdRP-SARSr-P2探针能够有效区分SARS冠状病毒(SARS-CoV)与SARS-CoV-2。CORMAN等[17]建议在常规检测中将E基因作为一线初筛靶区，RdRP基因用于验证性检测靶区。SHIRATO等[18]应用巢式实时荧光定量RT-PCR法检测SARS-CoV-2，从患者各类标本中提取SARS-CoV-2总RNA，在逆转录酶作用下通过随机引物和寡核苷酸引物合成第一链cDNA，随后进行第1次PCR扩增，取1 μL PCR扩增产物在相同的PCR热循环条件下通过第2对引物进行第2次嵌套PCR扩增，将PCR产物进行纯化测序。巢式实时荧光定量RT-PCR法检测SARS-CoV-2不仅能够减少错误扩增还具有与实时荧光定量RT-PCR法同等的灵敏度和特异度。为防止临床检测标本污染出现假阳性结果，可通过带有VIC荧光基团标记的探针(VIC-AGC TAG CGC ATT GGA TCT CG-MGB)判断标本是否被污染。此外，有多位研究者针对SARS-CoV-2的S基因设计了特异性引物，通过实时荧光定量RT-PCR成功检测到SARS-CoV-2[10,18]。XIE等[19]对19例疑似患者的口咽拭子、血液、尿液和粪便标本进行实时荧光定量RT-PCR检测，口咽拭子标本阳性检出率与粪便标本阳性检出率接近，而血液和尿液标本检测结果均为阴性，提示粪口传播可能是SARS-CoV-2传播途径之一。根据XIE等[19]研究结果显示，咽拭子、血液、尿液和粪便标本中SARS-CoV-2的核酸检测总阳性检出率仅为47.4%，认为对疑似COVID-19患者进行单项核酸检测有较高的漏诊率，建议将CT作为核酸检测的重要补充检查手段。对4例COVID-19患者的痰标本和咽拭子检测表明，痰标本中SARS-CoV-2基因扩增信号高于咽拭子，提示在对COVID-19患者行实验室检测时咽拭子核酸检测阴性不能完全作为排除标准，应采集痰等标本进一步检测[20]。

截至2020年4月25日，国家药品监督管理局(NMPA)共批准了之江、捷诺、卓诚惠生等12家SARS-CoV-2荧光PCR法核酸检测试剂盒，其中华大生物核酸检测试剂盒靶向ORF1ab区，圣湘、明德、金豪、硕世、达安核酸检测试剂盒靶向ORF1ab、N双区，之江、伯杰、捷诺、卓诚惠生、迈克生物、复星长征核酸检测试剂盒靶向ORF1ab、N和E 3个区，在检测标本时应严格按照各公司试剂盒要求进行检测以减少误差。实时荧光定量RT-PCR技术用于SARS-CoV-2检测对现阶段COVID-19的早发现、早隔离、早鉴别、早诊断、早治疗具有重要意义[21-22]，符合现阶段我国临床检验工作需要，因此我国将实时荧光定量RT-PCR检测结果作为确诊SARS-CoV-2感染的重要依据。最近有报告指出，实时荧光定量RT-PCR技术针对SARS-CoV-2检出准确率仅30.0%～50.0%[23]，在后续SARS-CoV-2检测工作中规范标本采集，多部位多标本联合检测，严格把控试剂盒质量，提高实验室质量控制等是提高核酸检测准确率的关键措施[13]。

2.3恒温扩增技术

2.3.1环介导等温扩增(LAMP) LAMP是一种新型的高效等温核酸扩增技术，多用于DNA和RNA核酸片段扩增，具有指数扩增、高特异度、高灵敏度等特点[24-25]。LAMP能够在4～6种不同的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶作用下快速恒温扩增核酸片段，识别6种不同的靶序列[26-27]。在检测SARS-CoV-2的过程中，通过优化LAMP实验条件，可以获得不低于甚至高于PCR的检测效果。POON等[28]以SARS-CoV-2基因组中ORF1ab作为检测靶区，通过LAMP检测获得与PCR技术一致的阳性检出率和灵敏度。HONG等[29]基于LAMP技术开发了一种通过光度计实时监测浑浊度的单管单步加速实时定量技术(RT-LAMP)，通过对临床标本检测显示RT-LAMP检测灵敏度是实时荧光定量RT-PCR法的100倍，检测限为0.01 pfu，可应用于SARS-CoV的早期快速诊断。YU等[26]开发了一种快速、简便的RT-LAMP技术(iLACO)，将LAMP系统与混合反应中的pH指示剂耦合，通过反应颜色改变进行识别。结果表明，iLACO反应时间与实时荧光定量RT-PCR循环数一致，但通过增大标本检测体积、提高引物浓度、升高反应环境温度可提高iLACO检测速度，并能区分SARS-CoV-2与其他冠状病毒和流感病毒，具有针对SARS-CoV-2的检测特异性。国内也开发出SARS-CoV-2的RT-LAMP检测试剂盒，可对血液、唾液、痰液、病毒空气等多种标本进行检测，可鉴别流感、SARS-CoV、MERS-CoV等病毒，可用于临床患者初筛、人群密集场所空气中病毒监测等[5]。优思达公司研制的实时荧光恒温扩增检测试剂盒，将LAMP技术与实时荧光技术相结合，目前已获NMPA审批，用于SARS-CoV-2核酸检测。此外，武汉中帜公司也已开发出金探针层析法RNA恒温扩增检测试剂盒。LAMP技术检测速度快、灵敏度高、准确率高，适用于现阶段临床检验工作，对COVID-19患者的早期发现和后期治疗具有重要意义。

2.3.2滚环扩增技术(RCA) RCA是一种在恒温条件下以类似微生物环状DNA分子复制方式扩增DNA或RNA核酸片段的技术[30]。RCA技术能够在少量的临床呼吸道标本中高效地检测出SARS-CoV[27]。RCA技术相较于PCR技术能够更好地避免假阳性结果同时具有灵敏度高、成本低等优点，RCA技术有望应用于SARS-CoV-2检测。

2.4基因芯片技术 基因芯片将特异性探针标记的扩增产物cDNA装载至基因芯片载体孔内，与固定在微阵列上的固相寡核苷酸杂交，经过一系列清洗步骤去除游离DNA，通过检测杂交信号分析被检标本中核酸的类别[14,23]。基因芯片技术能够快速、高通量检测病毒核酸。目前已开发出能够快速检测呼吸道多种病毒的全新微流控芯片，该芯片能够在1.5 h内一次性检测出包括SARS-CoV-2在内的19种常见的呼吸道病毒(参考网站：http://www.tsinghua.org.cn/xxfb/xxfbAction.do?ms=ViewFbxxDetail_detail0&xxid=14749756&lmid=4000419)，此外我国其他研究团队也已开发出了检测SARS-CoV-2的基因芯片[14]。基因芯片在SARS-CoV-2检测中具有快速、高通量的优势，但灵敏度较低、检测成本高且需要专业配套设备，难以在基层临床实验室推广。

3 免疫血清学检测

3.1ELISA 应用ELISA检测抗体或抗原对SARS-CoV-2辅助诊断具有重要意义。有研究者将与SARS-CoV-2核衣壳蛋白有92%相似的来源于重症急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARSr-CoV)Rp3的交叉反应性核衣壳蛋白作为抗原开发了抗SARSr-CoV IgG和IgM ELISA试剂盒，可用于检测SARS-CoV-2[9]。检测结果表明，在采样第1天COVID-19患者的IgG和IgM效价均较低甚至无法检测，在采样的第5天所有患者的病毒抗体效价均升高，其中IgG阳性检出率从50%上升到81%，IgM阳性检出率从81%上升到100%，高于PCR的阳性检出率[9]。将血清学和核酸检测联合可以提高COVID-19的阳性检出率[9]。采用纯化的重组SARS-CoV-2 N蛋白(rNPs)作为包被抗原，间接ELISA法检测82例确诊和58例疑似COVID-19病例血浆标本抗体，同时与PCR结果进行比较，结果表明，症状出现后的1～3 d内PCR阳性检出率大于90%，6 d时下降至80%以下(95%CI：57.1%～95.7%)，14 d时降至50%以下(95%CI：23.7%～59.5%)[10]。IgM阳性检出率随着症状出现后天数呈逐渐上升的趋势，5.5 d后IgM ELISA的阳性检出率开始高于PCR。研究还显示单次PCR的阳性检出率仅51.9%，PCR联合IgM检测能显著提高阳性检出率[10]。此外，也可通过ELISA技术对被测标本中的病毒抗原成分进行定性或定量检测。目前，日本富士公司研发的SARS-CoV-2抗原检测试剂盒已获日本药品医疗器械评价中心审批，该试剂盒能在15～30 min内检测出SARS-CoV-2，但精准度要低于PCR。ELISA具有标本采集处理简捷、操作技术要求低、灵敏度高、特异度强、检测成本低等优点，适用于基层医院批量检测。尽管如此，由于存在交叉反应等造成的假阳性，NMPA批准的SARS-CoV-2抗体检测试剂盒建议将抗体检测作为SARS-CoV-2核酸检测阴性疑似病例的补充检测手段或在疑似病例的诊断中与核酸检测联检，但不作为SARS-CoV-2感染确诊和排除的依据，不适用于一般人群的筛查。

3.2GICA GICA是一种以胶体金作为标记物，用于检测抗原抗体复合物的新型免疫标记检测技术。邓杰伦等[31]报道GICA检测SARS-CoV-2 IgM和总抗体的特异度均大于90%，符合率均大于70%。目前NMPA已批准诺唯赞、英诺特、珠海丽珠等多家公司的GICA IgM/IgG抗体检测试剂盒投入临床使用。和ELISA比较，GICA具有更加快速、经济、操作简便等优势，对COVID-19的流行病学调查具有一定的意义[31]。

3.3CLIA CLIA是将免疫反应系统和化学发光分析系统相结合的一种免疫测定技术。唐鹏等[32]将191例确诊和疑似COVID-19患者血清标本分为持续阳性组、阳性转阴组、疑似组，同时采用CLIA和GICA检测，结果表明，GICA和CLIA检测SARS-CoV-2特异性抗体临床特异度为100%。持续阳性组GICA和CLIA比较，差异无统计学意义(P>0.05)。阳转阴组和疑似组CLIA检测总抗体的阳性检出率明显优于GICA。迈克生物、博奥赛斯等公司研发的CLIA IgG、IgM抗体检测试剂盒已获得NMPA应急审批。在COVID-19的诊疗过程中，CLIA测定总抗体优于GICA，且能够定量。

4 展 望

SARS-CoV-2传染性强，目前尚未研究出治疗COVID-19的特效药物，预防SARS-CoV-2感染的疫苗仍处于临床研究阶段，因此对SARS-CoV-2感染者的早发现、早诊断、早隔离是现阶段控制疫情蔓延的关键。实验室检测技术在对SARS-CoV-2感染者早期筛查的工作中尤为重要。检测方法中实时荧光定量RT-PCR、恒温扩增、基因芯片和测序等技术各具优点，对临床诊断SARS-CoV-2和判断疗效方面具有重要意义。ELISA、GICA等血清学的检测方法具有操作简洁、耗时短等优点，适用于流行病学监测、核酸检测的补充或可用于基层防控工作。核酸检测联合血清学检测能够提高阳性检出率，对现阶段疫情防控工作具有重大意义。