CRISPR/Cas9基因编辑技术在蚊媒研究中的应用

李满金 兰策介 李春晓

(军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家 重点实验室，北京市虫媒病与自然疫源性疾病重点实验室，北京100071)

蚊虫传播疟疾、登革热、黄热病、寨卡等多种虫媒传染病，给全球公共卫生事业带来了巨大威胁(Weaveretal., 2004; Weaver, 2005; Weaveretal., 2010)。21世纪以来，基因编辑技术开始应用于生命科学各个领域，包括蚊媒研究领域。最初，基因修饰主要通过基于真核转录因子的锌指核酸内切酶(Zinc finger nuclease, ZFN)(Porteusetal., 2005; Urnovetal., 2005)和转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)(Moscouetal., 2009; Christianetal., 2010)两种技术，然而这两种技术由于效率较低且设计复杂等局限性并没有得到大范围的应用。近年来开发的第3代人工核酸内切酶基因编辑技术，CRISPR/Cas9系统能够靶向特异性的修改目的基因，包括基因插入、敲除和修饰(Horvathetal., 2010)。并且由于其编辑效率高、特异性强、操作简单且成本低，被认为是最具有广阔应用前景的基因组定点编辑工具。

1 CRISPR/Cas9系统

1.1 CRISPR/Cas9系统的提出与发展历程

1987年，日本Nakata团队在参与碱性磷酸酶同工酶转化过程的K12大肠杆菌中发现一系列串联间隔重复序列(Ishinoetal., 1987)。此后大量微生物基因组被测序，间隔重复序列被广泛发现于细菌和古细菌中，到2000年Mojica团队证实超过40%的细菌和古细菌中存在该序列(Mojicaetal., 2000)。2002年，正式提出CRISPR这一概念(Jansenetal., 2002)，证实了保守的毗邻CRISPR相关蛋白(Cas)，并归纳了3种不同的CRISPR系统(类型Ⅰ-Ⅲ)(Haftetal., 2005)。专家推测CRISPR基因座中的间隔序列(Spacer)可能参与微生物的免疫反应，调节病毒防御机制(Bolotinetal., 2005；Mojica, 2005；Pourceletal., 2005)。2007年，Barrangou等(2007)首次实验证明Ⅱ型CRISPR系统在适应性免疫系统中的作用。到2013年，张锋团队和Church实验室(Congetal., 2013; Malietal., 2013b)前后实现了嗜热链球菌和化脓性链球菌中的Ⅱ型CRISPR系统在哺乳动物细胞中的基因编辑。这两篇文献发表后将CRISPR/Cas9系统在真核生物中的应用推进新的阶段，并在当年被《Science》杂志评为顶级十项科学突破之一，之后CRISPR/Cas9系统被广泛用于各种实验模型，至此将基因编辑技术的研究与应用推向了新的领域。

1.2 CRISPR/Cas9系统的结构与作用机理

以目前应用最广泛的发现于化脓型链球菌中的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统为例，CRISPR/Cas9系统包括3个部分：特异性的CRISPR相关RNA(CRISPR-derived RNA, crRNA)、反式激活的crRNA(Trans-activating crRNA, tracrRNA)、CRISPR相关的核酸内切酶9(CRISPR associated sequences 9, Cas9)(Hsuetal., 2014)。此外，之后的研究人员将包含靶向指导序列的crRNA融合到tracrRNA中，构建出的单链导向RNA(Single guide RNA, sgRNA)，可以代替crRNA-tracrRNA复合体，指导Cas9核酸内切酶定向切割双链DNA(Jineketal., 2012)。总体来说，CRISPR-Cas反应包括3个阶段(Bondy-Denomyetal., 2015; Mohanrajuetal., 2016; van Houteetal., 2016; Shmakovetal., 2017)。第1阶段称为适应阶段，Cas1-Cas2蛋白复合物切除目标DNA序中的原型间隔子(Protospacer)，并将其插入 5′ 末端的CRISPR重复序列之间产生一个新的间隔子。第2阶段为表达和加工阶段，CRISPR序列与新的间隔子一起转录为前体crRNA(Pre-crRNA)，并由特殊的Cas9加工成成熟的crRNA。第3阶段为干扰阶段，crRNA与Cas9蛋白结合形成复合体识别原型间隔序列毗邻基序(Protospacer adjacent motif, PAM)前的靶点序列，激活Cas9中的HNH和RuvC结构域产生切割功能，从而产生DNA双链断裂(Double-DNA strand breaks, DSBs)，再借助机体的非同源末端连接(Nonhomologous end joining, NHEJ)或同源修复(Homologous-directed repair, HDR)等自我修复方式，从而实现基因组的定点插入、敲除或修饰(Jackson, 2002)。

2 CRISPR/Cas9系统在蚊媒研究中的应用

CRISPR/Cas9系统出现后，由于其简单方便的操作方法和低廉的成本而得以迅速推广使用。尤其是，2013年在真核生物细胞中成功应用CRISPR/Cas9系统，使得这一强大的基因编辑技术逐渐被广泛应用于各个领域的各种生物中。目前CRISPR/Cas9系统已在基础研究、农业生产、特别是临床医学研究等领域得到了广泛应用，如寻找潜在药物靶点、治疗由已知遗传因素导致的疾病等。迄今为止，CRISPR/Cas9 系统已经成功应用于果蝇(Renetal., 2014; Seboetal., 2014; Gratzetal., 2015; Portetal., 2016)、家蚕(Wangetal., 2013; Maetal., 2014; Maetal., 2017)、蝴蝶(Lietal., 2015; Markertetal., 2016; Zhangetal., 2016)等昆虫。具有高度特异性和灵活性的CRISPR/Cas9系统也被应用于媒介蚊虫，给蚊媒防治策略的开展提供更多的可能。Kistler等(2015)首先利用埃及伊蚊Aedesaegypti证明了CRISPR/Cas9系统具有在蚊虫中产生位点特异性突变的能力，并建立了几个基因组位点稳定突变的种系。他们研究了注射不同比例Cas9蛋白和sgRNA混合物后对基因的编辑效率，提出注射400 ng/μL的重组Cas9蛋白可以产生最高的突变率；同时他们还研究了不同注射比例对胚胎存活率的影响，发现注射333 ng/μL的重组Cas9蛋白蚊虫胚胎存活率为46.1%～63.3%，而注射500 ng/μL的胚胎存活率只有18.6%；随后，通过注射sgRNA和长度为200 bp的单链寡脱氧核苷酸(Single-stranded DNA oligodeoxynucleotide, ssODN)并检测G0、G1代产生的插入缺失和ssODN插入的比例，表明了非同源末端连接修复发生的可能性高于同源修复，证明了CRISPR/Cas9通过不同的修复机制产生不同类型的突变的能力。这项研究对CRISPR/Cas9在蚊虫中的应用进行了详细的探索，使以前无法进行基因编辑的非模式生物的相关研究有了新的可能。

2.1 CRISPR/Cas9系统在蚊虫表型修饰及筛选中的应用

Dong等(2015)针对共同表达眼部特异性红色荧光蛋白(Red fluorescence protein, RFP, DsRed)和增强型蓝绿色荧光蛋白(Enhanced cyan fluorescent protein, ECFP)的埃及伊蚊中的ECFP进行CRISPR基因敲除，通过注射Cas9和两个靶向ECFP基因不同区域的sgRNA复合物，最终得到G1的编辑效率为5.5%，得到2～27个碱基的插入缺失。该研究的编辑效率不同于之前研究报道中的超高效率，说明在埃及伊蚊中，CRISPR/Cas9的编辑效率存在较大的差异，可以进一步改善靶点位置的选择，优化sgRNA的设计。这项研究使得我们能够利用简单的视觉筛选系统筛选突变体，快速视觉筛查系统的使用非常重要，因为无法预知我们的CRISPR / Cas9构建体是否起作用。Liu等(2018)首次在白纹伊蚊Aedesalbopictus中使用CRISPR/Cas9技术，靶向敲除了酪氨酸羟化酶(Kynurenine hydroxylase, Kh)和多巴胺色素转化酶(Dopachrome conversion enzyme, Yellow)两个基因，在G1的蛹和成虫中可以观察到眼睛和身体色素沉着缺陷，表明成功地产生了高度可遗传突变，从而证明了CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术可以在白纹伊蚊中应用，作为基因组学分析和生物学研究的有效工具。同年，在白化按蚊Anophelesalbimanus、科鲁齐按蚊An.coluzzii和福涅斯特按蚊An.funestus中成功应用了CRISPR/Cas9技术(Lietal., 2018)。他们通过靶标眼部特异性基因White protein(三种按蚊基因转录本ID：AALB006905-RA、ACOM037804-RA、AFUN003538-RA，来自Vectorbase数据库)产生马赛克效应，证实了CRISPR/Cas9系统在先前基因编辑技术效率低或无法编辑的物种中也拥有较高的效率。

2.2 CRISPR/Cas9系统在控制病原感染蚊虫研究中的应用

在斯氏按蚊An.stephensi中首次利用高效Cas9介导的基因驱动技术进行种群修饰，通过该系统基因修饰的雄性和雌性后代表现出高频率的同源修复(Gantzetal., 2015)。随后，实验人员将一个约17 kb的构建体从其插入位点复制到其同源染色体上，在该基因修饰品系与野生型蚊虫杂交后，99.5%的后代带有双重抗疟原虫效应基因和标记基因。Dong等(2018)利用CRISPR/Cas9技术破坏了冈比亚按蚊中的纤维蛋白原相关蛋白1(Fibrinogen-related protein 1, FREP1)基因序列，该蛋白是一种激动剂，参与疟原虫对媒介蚊虫的生物学反应，影响蚊虫对疟原虫的易感性和蚊虫自身的适应性。产生基因突变后的蚊虫不但对疟原虫感染产生明显抑制作用，而且对蚊虫的吸血行为、繁殖能力、卵的孵化率、化蛹时间和寿命长短等方面均有影响。

2.3 CRISPR/Cas9系统在蚊虫发育繁殖代谢研究中的应用

Hammond等(2016)将CRISPR辅助的基因驱动系统应用于疟疾媒介蚊虫冈比亚按蚊，针对3个基因(基因转录本ID：AGAP005958-RA、AGAP011377-RA、AGAP007280-RA，来自Vectorbase数据库)开展研究，这些基因参与蚊虫产卵和胚胎发育的不同阶段，应用CRISPR/Cas9系统靶向破坏了这些基因后雌蚊会产生不育表型，并将每个基因的基因座插入CRISPR/Cas9基因驱动构建体，可在91.4%～99.6%的子代中观察到相应表型，并在4代内快速入侵该种群，造成种群数量大幅度减少。通过在埃及伊蚊中设计microRNA-309(miR-309)的特异性sgRNA，开发了针对microRNA(miRNA)的基因组突变技术。实验中注射的胚胎大约有51.5%的存活率，证明使用CRISPR/Cas9技术可以有效地破坏miR-309基因位点，并且在存活的胚胎中编辑效率达到了64.1%。CRISPR/Cas9产生的miR-309突变体的卵巢未能发育出正常的初级卵泡，表明miR-309在雌蚊卵巢卵泡发育中起关键作用(Zhangetal., 2016)。Lin等(2017)通过CRISPR/Cas9技术对miR-277位点产生突变，并通过CRISPR辅助的单链寡聚脱氧核苷酸介导的同源修复，明确了miR-277缺失与叉头转录因子(Forkhead box O，FOXO)信号转导通路之间存在关联，证明了miR-277在FOXO信号转导通路中起到关键作用，从而影响了雌蚊繁殖功能和脂质代谢。这些研究都为种群数量的控制提供了新的思路。

2.4 CRISPR/Cas9系统在蚊虫种群控制中的应用

性别是蚊虫防控中的重要考虑因素，蚊虫传播疾病是通过叮咬受感染的个体获得病毒，病毒在体内复制一段时间再叮咬传播另一宿主，而只有雌蚊在交配后才会产生吸血行为进而使卵巢和卵发育繁殖后代，如何使雌蚊数量减少，或影响雌蚊发育，是控制蚊虫种群数量的重要切入点。针对埃及伊蚊的雄性决定因子Nix基因进行CRISPR/Cas9基因编辑，该基因主要影响蚊虫向雄性转化(Basuetal., 2015)。进一步对Nix基因进行敲除，发现Nix编码一个潜在的剪接因子，其缺失可产生双性和无性别分化两种选择性剪接，从而导致雄蚊很大程度上雌性化(Halletal., 2015)。该研究将雌蚊转变成无害的雄蚊，从而为控制蚊虫的数量提供了新的思路和策略。Hammond等(2017)在冈比亚按蚊中首次发现了第1个功能性CRISPR/Cas9性别紊乱系统。在被测试的4个冈比亚按蚊基因修饰品系中，所有品系均表现出强烈的性别比差异，雄性后代的比例可到达86.1%～94.8%，孵化率在83.6%～93.2%之间。针对调控冈比亚按蚊性别分化的另一基因双性基因(Anopheles gambiae doublesex，Agdsx)开展研究(Kyrouetal., 2018)，Agdsx的两个转录体dsx-雌性(AgdsxF)和dsx-雄性(AgdsxM)分别控制两个方向的性别分化。不同于AgdsxM，AgdsxF中包含雌性特异性的5号外显子，以CRISPR/Cas9靶向破坏4号内含子和5号外显子的交接序列从而阻止功能性AgdsxF的形成，但不会影响雄性的发育或生育能力，使后代出现等位基因纯合突变的雌蚊表现出双性或不育表型。随后，在实验室种群中构建AgdsxF基因驱动系统，结果表明在7～11代内雌蚊表现出双性或不育表型，覆盖率可达100%，并且伴随着蚊卵的减少，种群数量快速减少最终导致整个种群崩溃。

Li等(2017)建立多个稳定表达Cas9蛋白的埃及伊蚊株系，使利用CRISPR系统进行基因编辑的一致性和效率得到显著改善，开发了基于Cas9基因驱动(Gene drive, GD)的埃及伊蚊新型种群控制技术。在冈比亚按蚊(Hammondetal., 2016)和斯氏按蚊(Gantzetal., 2015)中也实现了基因驱动技术。这些结果为进一步发展Cas9介导的基因驱动技术奠定了基础，既可以用于构建携带抗病原效应基因的转基因蚊虫，也可以用于生成能够渗入整个野生种群基因的基因驱动系统，例如雄性决定因子Nix基因。这些研究为今后疟疾等蚊媒疾病的防治、蚊虫种群数量控制提供了一种新的方法。

2.5 CRISPR/Cas9系统在蚊虫中的其他应用

Basu等(2015)除了对上文描述的Nix性别决定基因进行编辑之外还对埃及伊蚊的5个有关DNA修复，RNAi的基因(kmo、lig4、ku70、loqs、r2d2)进行了CRISPR/Cas9基因编辑，发现在G1胚胎中的基因编辑率高达90%。在研究中，他们还发现在基因组不同位置编辑效率不同，从而进一步设计了40条不同靶点的sgRNA来评估不同位点的编辑效率，为利用CRISPR/Cas9系统进行蚊虫基因编辑、提高编辑效率提供了一条新的思路。Itokawa等(2016)首次报道了在致倦库蚊Culexquinquefasciatus抗性品系中使用CRISPR/Cas9技术靶向敲除了细胞色素P450基因(CYP9M10)，研究证明突变幼虫拟除虫菊酯抗性下降了100倍以上。尽管这些物种可能不适合进行胚胎显微注射，但通过实验比较各种编辑技术的效率，CRISPR/Cas9尽管有某些缺点和限制，但其仍然有较高的编辑效率，新型的编辑技术将大大推进非模式昆虫的相关问题研究，并有助于拓展我们在该领域的知识。

3 讨论与展望

CRISPR/Cas9基因编辑工具已在媒介蚊虫基因组修饰的研究工作中发挥着巨大作用，这种工具可用于更深层次的研究靶标基因的插入/缺失、倒位、重复、多态性等多种问题，并有助于研究蚊虫和病原体的相互作用，以其高效率的靶标特异性和简单低成本的优势迅速替代了ZFN和TALEN等原先的基因编辑工具，在修饰媒介蚊虫的基因组研究中占据主要位置。但由其所产生的脱靶效应、基因驱动种系所带来的生态问题等也不容忽视。

目前已在多个研究中报道了有关脱靶效应的问题(Fuetal., 2013; Malietal., 2013a；Pattanayaketal., 2013)，而且由于蚊虫基因组相对较大，所以存在的潜在脱靶序列数量增加，可能需要更精确的靶点选择。针对脱靶问题，不少学者也提出了解决办法，比如对Cas9蛋白进行突变构建一个切口酶，再设计2个sgRNA对位点上下游同时进行切割，通过两次识别提高准确性降低脱靶效应(Ranetal., 2013)。一种新型高保真Cas9蛋白(SpCas9-HF1)，比原先的Cas9蛋白具有更低的脱靶率(Kleinstiveretal., 2016)。还有很多研究者开发一系列软件和相关网站来预测可能的脱靶位点，如Digenomeseq软件(Kimetal., 2015)、ZiFit、CRISPR Design等网站，但由于许多蚊虫种类缺乏完整的基因组，因此无法将这些工具应用于所有蚊种。

此外，有关于借助同源修复而产生的基因驱动策略中也存在严重问题(Esveltetal., 2014; Uncklessetal., 2017)。为了获得有效的基因驱动，我们必须确保是通过HDR而不是NHEJ来修复序列，这在某些种类的蚊虫中可能具有挑战性，从而会导致超出预期水平的不良后果。释放到环境中的基因修饰的品系可能会对生态系统造成不良影响，例如修饰后的蚊虫在自然环境中的存活率，对食用转基因蚊虫幼虫的捕食性昆虫和鱼类的影响以及消灭媒介蚊虫后引起的生态失衡等问题(Reeganetal., 2017)。而且由于其“无痕”的修饰方式，到目前为止我们还没有方法可以在现场条件下检测编辑导致突变的蚊虫，并且无法将其与发生自然突变的蚊虫进行鉴别(Ledford, 2015)。

世界各地的研究者们都有机会充分利用CRISPR/Cas9这一基因编辑技术来拓展自身的研究领域，特别是在媒介蚊虫的控制方面。CRISPR系统的创造性是无限的，自从这一系统被发现以来，人们不断的深入挖掘其更多的可能，不断拓展其功能和应用范围，基因编辑技术变得更加高效和便捷。随着CRISPR系统在蚊虫中的应用的成熟，我们仍需不断努力提高该技术的特异性和效率，开发更多的方法使其更多的适用于各种蚊虫种系甚至其他非模式生物, 从而达到控制蚊虫种群、阻断蚊媒体内病毒的复制与传播、防治甚至消除蚊媒疾病的目的。