光-氧氧化预处理褐煤微生物降解效果提升的原因*

李建涛 刘向荣 杨 杰 庄肃凯

(1.商洛学院化学工程与现代材料学院，726000 陕西商洛；2.陕西省尾矿综合利用重点实验室，726000 陕西商洛；3.西安科技大学化学与化工学院，710054 西安)

0 引 言

我国的煤炭生产和消费长期位列世界第一，以煤炭为主的能源结构短期内很难改变。因此，对煤炭清洁利用的探索一直是重要的研究方向[1]。煤的微生物降解是继煤炭的液化和气化加工技术后的新型煤炭清洁转化技术，其液体降解产物可以分离精细化学品和生产液体燃料等，固体降解产物可用作化肥或吸附剂等的腐植质生产。该技术只需要在室温、常压下进行，具有反应条件温和、反应设备要求简单、低耗能和环境友好等优点[2-5]，在煤炭特别是低阶煤的清洁高效利用方面，具有一定的发展前景。

新采出的原煤大多不易被微生物直接作用，需要进行前处理才能具有较好的降解效果，煤的预处理方法较多(如硝酸氧化、光-氧氧化、臭氧和双氧水氧化等)。目前，采用较多的煤预处理方法为硝酸氧化法，该方法对提高煤的微生物降解效果较好[6-9]。但硝酸由于强酸性和腐蚀性，在实际操作过程中存在诸如需水量大、环保性和安全性差，对设备的腐蚀性以及大规模作业的可操作性差，对煤的结构破坏较大，可能引入硝基，导致最终可利用的化学品结构和种类发生较大改变等问题。为此，有学者使用了光-氧氧化预处理煤[10-11]，进而进行微生物降解的方法，该方法很大程度上可以弥补硝酸氧化法存在的不足，具有实际应用前景。

本实验利用自行设计并加工的旋转床光化学反应器[12]，按照前期单因素和正交实验优化确定的光-氧氧化预处理内蒙胜利褐煤的最佳工艺条件对四种低阶煤进行光-氧氧化预处理。该方法与前人的不同之处在于：煤样始终处于运动状态，使得紫外光均匀照射煤样，保证了煤样在紫外光和高浓度氧气气氛中，能够均匀、高效地进行光-氧氧化反应。再利用黄孢原毛平革菌对原煤和光-氧氧化煤进行降解实验，以降解液的吸光度α450为指标，对降解效果进行对比研究。通过对原煤及光-氧氧化煤微生物降解前后的性质和结构进行表征，进一步分析光-氧氧化预处理煤对提升其微生物降解效果的原因。

1 实验部分

1.1 煤样

实验用煤样为内蒙胜利褐煤(SLH)、云南昭通褐煤(ZTH)、山西浑源褐煤(HYH)和内蒙元宝山褐煤(YBH)，各煤样破碎至粒径为20 mm以下，在60 ℃条件下，烘干3 h，粉磨、筛分得到粒度范围为0.075 mm～0.150 mm的煤样。各煤样经光-氧氧化预处理后，分别称为：氧化内蒙胜利褐煤(GSLH)、氧化云南昭通褐煤(GZTH)、氧化山西浑源褐煤(GHYH)和氧化内蒙元宝山褐煤(GYBH)。

1.2 菌株及培养基

所用菌种为黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，CGMCC编号：3.7212。该菌株能降解多种污染物，且解酯酶、纤维素酶活性高，其固体培养和液体培养形貌如图1所示。采用的培养基为改良马丁培养基：蛋白胨为5 g，酵母浸出粉为2 g，葡萄糖为20 g，磷酸氢二钾为1 g，硫酸镁为0.5 g，(固体培养基加琼脂15 g)，蒸馏水为1 000 mL，pH值6.2～6.6。

1.3 主要仪器

旋转床光化学反应器，自行设计加工；TU-1900型紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；ASAP2020比表面积-孔隙度分析仪，美国麦克公司；F2KA56960超纯水仪，美国MILLPORE公司；SW-CJ-1FD单人单面超净工作台，苏州净化设备有限公司；BL-50A立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HZQ-F100恒温振荡培养箱，太仓市豪诚实验仪器制造有限公司；BC-360生化培养箱，苏州市威尔实验用品有限公司等。

1.4 煤样的光-氧氧化预处理方法

对煤样进行光-氧氧化预处理的仪器为旋转床光化学反应器，主要由反应装置和旋转传动装置组成。反应装置包括反应箱和旋转床，反应箱内壁均匀设置紫光灯，旋转床主体为高纯石英管。当石英管在传动装置的带动下旋转时，煤样在石英管内处于运动状态，紫外光透过高纯石英管对煤粒进行均匀照射，光氧化反应发生。

图1 黄孢原毛平革菌形貌Fig.1 Features of Phanerochaete chrysosporiuma—Solid media；b—Liquid media

利用旋转床光化学反应器对褐煤进行光-氧氧化预处理的工艺条件采用前期单因素实验和正交实验方差分析确定的最佳工艺条件：煤样取(20±0.000 2) g，粒度为0.075 mm～0.150 mm，紫光灯功率为150 W，马达转速为120 r/min，通氧时间为40 min，氧化反应时间为42 h。用分析天平称取干燥过的煤样(20±0.000 2) g，加入石英管内，并用长柄药匙将煤样均匀摊开。然后塞上石英管两端的橡胶塞，打开两端橡胶塞上的导气管，一端导气管用橡胶管接到氧气瓶上，调好氧气流量为200 mL/min，通入氧气40 min，赶出石英管内大部分空气后，断开氧气瓶连接，关闭两端橡胶塞上的导气管阀门；打开紫光灯(λ=254 nm)和马达开关，通过变速器旋钮调节马达转速为120 r/min，光-氧氧化实验开始，反应42 h后，依次关闭紫光灯、变速器和马达开关，反应停止，倒出煤样。然后，将反应器倾斜并平稳放置，用长柄软毛刷刷洗石英管，并分别用自来水和去离子水冲洗石英管。最后用热风机吹干石英管，装配好反应器，以备下次使用。

1.5 煤的微生物降解方法

1.5.1 菌种的活化和复壮

活化：实验所用仪器、物品全部灭菌，操作在超净实验台上进行。按1.2节中培养基组成配制培养基，分装灭菌，固体培养基倒平板。取4 ℃斜面保藏的黄孢原毛平革菌少许放入装有玻璃珠和50 mL无菌水的锥形瓶中，塞好塞子后，剧烈振荡，使种子液均匀分散，用涂布棒蘸取菌液，接种于平板中，接种的培养皿倒置于30 ℃、相对湿度为80%的人工气候培养箱，培养5 d，菌体铺满培养皿。

复壮：取少许培养皿中活化的菌体，加入到装有玻璃珠和50 mL无菌水的锥形瓶，塞好塞子后，剧烈振荡，涂布平板法接种于倒好的平板中，将接好菌的培养皿倒置于30 ℃、相对湿度为80%的人工气候培养箱，培养5 d，菌体铺满培养皿。如此培养三代。

液体培养：取五角硬币大的一块复壮的菌体，放入装有200 mL无菌水和玻璃珠的500 mL 锥形瓶，塞好塞子，剧烈振荡，用接种环蘸取含菌水一孔，接种至装有100 mL液体培养基的250 mL锥形瓶中，在恒温培养箱中振荡培养2 d，作为母菌液，用于降解实验。此时的菌液利用血球计数法结合前期根据比浊法建立的菌液560 nm处吸光度与孢子个数之间的线性关系方程[13-14]，计算得出黄孢原毛平革菌孢子浓度为2.3×106个/mL。

1.5.2 黄孢原毛平革菌降解褐煤方法

在装有50 mL液体培养基的若干个250 mL锥形瓶中，煤与培养基以1 g∶10 mL的煤浆浓度加入煤样，接种量按母菌液与培养基10%(体积分数)，用移液枪接种黄孢原毛平革菌，每个实验做三组平行实验，置于30 ℃、振荡频率为160 r/min的恒温培养箱中，培养25 d[15-17]。将锥形瓶中的降解产物离心(10 000 r/min，10 min)，上清液过滤，滤液过0.22 μm微孔滤膜，以去离子水为参比，利用TU-1900型紫外-可见分光光度计检测滤液在450 nm处的吸光度α450，作为降解效果的评判指标。

1.6 煤微生物降解效果的评价方法

常用的煤微生物降解效果的评价方法主要包括重量法和吸光度法等，本实验采用吸光度法。煤样经微生物降解后，液体中含有煤降解产物而呈现出黑褐色，其对光束存在一定的散射和吸收作用，因此，利用紫外-可见分光光度计测定黑褐色降解液在波长为450 nm处的吸光度α450，并以此对微生物降解煤的效果进行评价。需要说明的是：通过降解液的α450值来判断微生物降解煤的效果是基于大量的紫外连续扫描数据及统计方法得到，而不是煤炭微生物降解所得液体产物的特征吸收波长[18-20]。由于实验中的加煤量较少，煤粒较细，煤经微生物降解作用后，菌体和煤粒分离不彻底、酸沉淀不完全以及实验随机误差等，导致重量法对溶煤效果的评价欠准确。本实验采用吸光度法，以降解液的吸光度α450值作为衡量微生物降解煤效果的的评判指标。

1.7 煤的性质检测

1.7.1 工业分析和元素分析

根据GB/T 30732-2014和GB/T 31392-2015对煤样分别进行工业分析和元素分析。工业分析中固定碳和氧元素的含量采用差减法计算得到。

1.7.2 FTIR检测

采用德国布鲁克公司生产的Tensor27型傅立叶变换红外光谱仪，测定样品的官能团结构特征。采用KBr压片法制样，将测试样品和溴化钾真空干燥，以m(coal)∶m(KBr)=1∶150混合并研磨压片。光谱仪分辨率为4 cm-1，扫描次数为32次，测定范围为4 000 cm-1～400 cm-1。

1.7.3 比表面积检测

采用低温液氮吸附法，利用美国麦克公司的ASAP2020全自动比表面-孔隙度分析仪，测定煤样的比表面积及孔隙结构特征。该吸附解吸相对压力范围为0.004～0.995，比表面积最低可测至0.000 5 m2/g。

1.7.4 润湿性表征

通过测定接触角，计算表面张力的方法来判定煤的润湿性。利用德国KRUSS公司的K100型表面张力仪测定，具体方法是：测量管的底部使用滤纸封闭，防止粉体漏失，将一定质量的煤粉装入样品测量管中压紧至一定高度，悬挂于仪器天平上，当管底与液体接触时，液体在毛细力的作用下，沿管上升，在t时间内上升高度h，该过程可由Washburn方程(1)来描述，测得式中各量，查得液体的相关物理常数，再计算表面张力。

h2=(γRcosθ/2η)·t

(1)

式中：γ为液体的表面张力，N/m；R为粉末柱的有效半径，m；η为液体的黏度，Pa·s；θ为接触角，(°)；t为时间，s。本研究选用液体为蒸馏水。

2 结果与讨论

2.1 黄孢菌对四种褐煤的降解效果

图2所示为四种原煤及其光-氧氧化煤的柱状效果。黑色柱是黄孢菌降解光-氧氧化褐煤降解液的吸光度α450值，白色柱是黄孢菌降解未经处理原煤的降解液吸光度α450值。由图2可知，光-氧氧化煤的黄孢菌降解效果较原褐煤均有较大幅度的提升。虽然光-氧氧化预处理采用的是以内蒙胜利褐煤为对象确定的最佳工艺条件，可能不是光-氧氧化预处理云南昭通褐煤、山西浑源褐煤和内蒙元宝山褐煤的最佳工艺条件，但由实验结果发现，按照该工艺条件氧化预处理这三种褐煤，黄孢菌对其氧化煤降解效果均比原褐煤有较大提升，而且黄孢菌对光-氧氧化云南昭通褐煤的降解效果优于光-氧氧化的内蒙胜利褐煤。故光-氧氧化预处理内蒙胜利褐煤的最佳工艺条件可以认为是处理云南昭通褐煤、山西浑源褐煤和内蒙元宝山褐煤的较优工艺条件，可在以后实验中采用。

图2 四种原煤及其氧化煤的黄孢菌降解液吸光度Fig.2 Liquid products absorbances of four kinds of raw lignite and oxidized lignite degraded by Phanerochaete chrysosporium

2.2 原煤及氧化煤的工业分析和元素分析

表1所示为四种原煤及其光-氧氧化煤的工业分析和元素分析。由表1可知，光-氧氧化煤较对应原褐煤的挥发分、水分、灰分均增大，固定碳含量减小。水分增大可能是因为，煤经光氧化作用后，含氧官能团增多，使得煤表面官能团极性增大，亲水性增强的缘故。挥发分的增大可能是因为，煤经光-氧联合作用发生了解聚降碳，生成了小分子易挥发物，挥发分的增大使得固定碳含量降低。

由表1还可知，各煤样的氧化煤含氧量和含氢量较对应原褐煤均高，而含碳量、含硫量、含氮量均减小。原因可能是，煤样在光和氧的气氛中发生了光-氧氧化反应，使得含氧量增加。氢含量的增加可能是因为，由于煤大分子某些结构单元与煤中或环境中的水发生了反应，引入了氢。硫与氮含量降低可能是其在紫外光和高浓度氧的气氛中发生了化学反应，生成了气体，逸散到气体中的缘故。氧化煤含氧量的增加有利于微生物对煤的降解。

表1 煤样的工业分析和元素分析(%*)Table 1 Proximate and ultimate analysis of samples(%*)

* Mass fraction.

2.3 原煤及其氧化煤的FTIR分析

红外光谱是对煤种官能团结构进行定性和定量分析，以获得煤大分子结构信息的重要手段。杨志远等[10,21]利用红外光谱研究了煤结构及官能团在低温氧化中的演变。煤样在经过光-氧氧化处理后，煤结构和官能团的变化仅通过简单的对比图谱和官能团的吸收峰情况说服力不强。本节根据文献[21-23]通过计算煤相关结构参数(富氢程度、富氧程度、脂芳比和缩合程度)，从而定量分析煤样在光-氧氧化预处理前后结构及官能团的变化情况。

四种褐煤及其氧化煤的红外光谱见图3。利用Peakfit 4.0软件对相关峰进行分峰高斯拟合，求峰面积。四种褐煤及其氧化煤的相关峰面积见表2，表2中C～S为红外光谱中的吸收峰代号[21]。根据各褐煤原煤及氧化煤红外光谱的煤结构参数定义(其中富氢程度参数为x1,x2,x3；富氧程度参数为y1，缩合程度参数为z1,z2,z3)及相关吸收峰面积，计算得到了相应煤样的结构参数值(见表3)。

由表3可知，通过对比表3中各褐煤及其氧化煤的结构参数，发现氧化煤的富氢程度均高于原煤，表现在煤样富氢程度的参数x1，x2，x3均增大(其中SLH与GSLH的x1相等除外)。各煤样氧化煤的富氧程度均增大，即各煤样氧化煤的y1值均大于相应原煤的值。对于缩合程度而言，没有明显的规律，但煤结构中的Ⅳ类氢原子吸收极弱(z3值趋于0)，表明低阶煤的缩合度很低。各煤样氧化煤的富氢程度和富氧程度增加，这与元素分析的结果相吻合。原因可能是，煤样在旋转床光氧化反应器内运动过程中，在紫外光的作用下，与较高浓度的氧气和煤中的水分发生了化学反应，从而使得含氢和含氧官能团增加。煤中含氧量的增加有利于微生物对煤的降解。

图3 四种原煤及其氧化煤的红外光谱Fig.3 FTIR of four kinds of raw lignite and oxidized lignitea—SLH；b—ZTH；c—HYH；d—YBH

表2 煤样红外光谱相关吸收峰面积Table 2 Absorption peak areas of FTIR of samples

表3 根据FTIR数据计算的煤结构参数Table 3 Structural parameters of samples calculated from FTIR data

2.4 原煤及其氧化煤比表面积及孔结构

微生物与煤大分子结构相互作用时，微生物及其所分泌的活性物质(酶、碱性物质、螯合物和表面活性剂等)必须与煤表面充分接触才能最大限度地对煤大分子进行降解作用，可见煤的表面积越大，越有利于降解作用的发生。因此，研究煤及氧化煤的比表面积及孔结构具有重要意义。

表4 四种原煤和氧化煤的比表面积(m2/g)Table 4 Specific surface areas of four kinds of raw lignite and oxidized lignite(m2/g)

氮气吸附检测的结果给出了煤样的BET比表面积、Langmuir比表面积、t-plot微孔比表面积和t-plot外比表面积(见表4)。由表4可知，分别对比四种褐煤与其氧化煤经不同方法计算的比表面积，发现氧化褐煤的BET比表面积、Langmuir比表面积和t-plot外比表面积均比原煤的比表面积大(t-

图4 四种原煤及其氧化煤的N2吸附-脱附等温线Fig.4 N2 adsorption/desorption isotherms of four kinds of raw lignite and oxidized lignite

plot微孔比表面积规律性不一致)。比表面积越大，微生物与煤粒作用时，微生物产生的降解煤活性物质与煤粒的作用面积就越大，这对煤的微生物降解有利。原煤经光-氧氧化预处理后，比表面积增大，可能是微生物降解氧化煤比原煤效果好的一个原因。而氧化煤比表面积的增大，可能是用于在光-氧氧化过程中，煤样的孔隙尺寸或者表面物理形貌发生了变化的缘故。

图4所示为四种原煤及其氧化煤的N2吸附-脱附等温线。由图4可知，原煤和氧化煤的滞后环形状相似，低压区吸附等温线偏x轴，说明N2与煤颗粒吸附作用较弱，所有滞后环均较小，出现在相对高压区。滞后环的特征对应于特定的孔结构信息，由原煤和氧化煤的滞后环形状，可判断为第Ⅲ类H3型孔，即认为是片状粒子堆积形成的狭缝孔[24-25]。片状煤粒堆积集合体在微生物降解煤的过程中，易于被微生物作用而剥离成为更小的片层单元，从而增大煤样的比表面积，有利于微生物降解煤的进行。

2.5 原煤及氧化煤的润湿性

四种褐煤及其氧化煤对蒸馏水的界面张力数据见图5。由图5可知，不同的煤样与水的界面张力有差异，且不同煤样原煤的界面张力均大于氧化煤样的界面张力。原因可能是，原煤经光-氧氧化预处理后，氧化煤结构中的氧含量增加，含氧官能团的增多使得煤表面的极性增强，从而更容易被水润湿，表现为与水界面张力的减小[26-27]。由此可以推测，氧化煤粒与水的界面张力减小，易于被水溶液润湿，使得微生物分泌的降解煤活性物质(碱、表面活性剂、螯合剂和酶等)更易与煤中的活性点充分接触并发生降解作用，从而提高了微生物对煤的降解率。

图5 四种原煤及其氧化煤的表面张力Fig.5 Surface tensions of four kinds of raw lignite and oxidized lignite

3 结 论

1) 黄孢原毛平革菌对四种光-氧氧化褐煤的降解效果和其原煤相比均有明显的提升。

2) 光-氧氧化煤和原煤相比，挥发分、水分、灰分均增大，固定碳含量减小；含氧量和含氢量均比原煤高，而含碳量、含硫量、含氮量均减小。

3) 光-氧氧化煤和原煤相比，富氢程度、富氧程度均增大，对于缩合程度而言，没有明显的规律，但煤结构中的Ⅳ类氢原子吸收极弱(z3值趋于0)，表明低阶煤的缩合度很低。

4) 光-氧氧化褐煤的BET比表面积、Langmuir比表面积和t-plot外比表面积均比原煤的大。由四种原煤和氧化煤的滞后环形状，可判断各煤的孔隙类型均为第Ⅲ类H3型孔，即认为是片状粒子堆积形成的狭缝孔。

5) 光-氧氧化褐煤与蒸馏水的表面张力比原煤与蒸馏水的表面张力低，即光-氧氧化煤更容易被润湿。

6) 光-氧氧化褐煤结构和性质的改变，可能是黄孢原毛平革菌对氧化煤降解效果优于原煤的原因。