碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的检测方法

周宏伟， 胡燕燕， 张 嵘

（浙江大学医学院附属第二医院检验科，浙江 杭州 310009 ）

随着碳青霉烯类抗菌药物在临床的广泛应用，细菌耐药形势日趋严峻。本文着重阐述目前国内外关于碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）的检测方法，以期为临床CRE感染相关疾病的诊治提供参考。

1 CRE的国内外流行情况及耐药机制

碳青霉烯类抗菌药物是目前临床上治疗多重耐药肠杆菌科细菌引起的感染的最有效的药物。但随着广谱抗菌药物在临床的广泛使用，多重耐药和泛耐药菌株日益增多，尤其是近几年，CRE的快速播散给临床抗感染治疗带来了极大的挑战，已成为严重的公共卫生问题[1]。中国CHINET细菌耐药性监测数据表明，2005年碳青霉烯类抗菌药物对肠杆菌科细菌保持着较高的抗菌活性，耐药率低于2%；到2010年，耐药率明显上升，达到5%；肺炎克雷伯菌的耐药率已高达10%[2]。肠杆菌科细菌对碳青霉烯酶类抗菌药物最常见的耐药机制为产碳青霉烯酶，其次是高产头孢菌素酶（ampicillin，AmpC）或超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBL）合并膜孔蛋白改变，主动外排系统过度表达和药物作用靶位改变引起的碳青霉烯类耐药较为少见[3]。目前报道的一些CRE检测方法主要也是针对是否产碳青霉烯酶。

2 CRE的实验室检测方法

2.1 表型筛选

2.1.1 纸片扩散法初筛试验 纸片扩散法是最简易的筛选方法，然而对于不同碳青霉烯类抗菌药物、不同菌种及不同的耐药机制，纸片扩散法所用的筛选抗菌药物亦不同，如筛查产KPC型碳青霉烯酶最好的抗菌药物为美罗培南[4]，而筛查产碳青霉烯酶菌株最敏感的抗菌药物为厄他培南[5]。产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌通常对三代头孢菌素耐药，但产SME或IMI型碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌对三代头孢菌素敏感[6-7]，对摩根摩根菌、变形杆菌属、普罗威登菌属的碳青霉烯类抗菌药物耐药筛查则需要检测除亚胺培南外的其他碳青霉烯类抗菌药物（如美罗培南或厄他培南）。

2.1.2 改良Hodge试验 2015年，美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐采用改良Hodge试验进行CRE筛查[8]。这一方法操作简单、成本低，无需特殊试剂和培养基，但仅可检测到产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌。主要步骤为：将大肠埃希菌（ATCC 25922）用无菌0.9%氯化钠溶液配制成0.5麦氏浊度的菌悬液，10倍稀释后涂布于M-H平板，在M-H平板上贴厄他培南或美罗培南纸片，用接种环以厄他培南或美罗培南为中心向平板边缘划1条接种线，35℃培养16～20 h后，如大肠埃希菌呈矢状生长，则判读为阳性，该待测菌产碳青霉烯酶；若未出现大肠埃希菌生长增强现象，则判读为阴性，该待测菌株不产碳青霉烯酶。

2.1.3 纸片筛选及协同试验 2017年，CLSI推荐采用改良碳青霉烯类抗菌药物灭活试验（carbapenem inactivation method，CIM）进行CRE的筛查，CIM可检出多种碳青霉烯类耐药基因型[9-10]。纸片协同试验是另外一种简单、易操作的CRE检测方法，该方法以碳青霉烯类抗菌药物纸片与碳青霉烯类抗菌药物加乙二胺四乙酸纸片抑菌环直径相差5 mm或5 mm以上判读为金属酶阳性；碳青霉烯类抗菌药物纸片与碳青霉烯类抗菌药物加苯硼酸纸片的抑菌环直径相差5 mm或5 mm以上判读为KPC型碳青霉烯酶阳性[11]。这一方法主要根据不同类别的碳青霉烯酶选择不同的酶抑制剂以检测CRE。

2.1.4 美国疾病预防与控制中心推荐的肉汤富集法及改良法 在5 mL胰酪胨大豆肉汤中加入1片含10 μg厄他培南或美罗培南的纸片，将待测样本接种于肉汤中，35℃培养过夜。吸取100 μL培养过夜的肉汤接种于麦康凯平板，于35 ℃培养箱中培养过夜。挑取麦康凯平板上分解乳糖的单个菌落，采用改良Hodge试验检测菌株产酶情况，采用Hodge试验阳性菌株进行鉴定确认是否为CRE[12]。改良方法：用棉签挑取适量粪便（约火柴头大小）接种到5 mL粪便增菌肉汤，35℃孵箱中孵育8～12 h。挑取1环第1次肉汤增菌后的增菌液接种到0.3 μg/mL美罗培南中国蓝平板上，35℃孵箱中孵育8～12 h，含药平板上生长的菌落经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）鉴定为肠杆菌科细菌即为CRE[13]。

2.1.5 CRE显色筛选培养基筛选法 CRE显色筛选培养基筛选法的检测原理是通过特异性的显色酶底物来鉴定菌种。培养基中含有特定的碳青霉烯类抗菌药物和抑制剂，可抑制敏感菌株和杂菌生长。通过改变显色培养基中的抗菌药物和抑制剂浓度，可以优化显色培养基检出CRE的敏感性和特异性[14]。

2.1.6 Carba NP试验 2015年，CLSI推荐采用Carba NP（CNP）试验检测CRE，检测原理为：细菌抽提物水解亚胺培南从而改变溶液pH值，通过pH指示剂的颜色变化进行结果判读。该方法快速、简单、成本低，无需设备，大部分微生物实验室均可以开展，可同时检测多种碳青霉烯酶。但此方法不适用于检测染色体编码的OXA型碳青霉烯酶，而且检测产ESBL或AmpC合并膜孔蛋白缺失的菌株时，会出现假阳性结果，因此仅适用于检测肠杆菌科细菌[8]。

3 基于聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和测序技术的筛查方法

基于PCR的耐药基因检测不仅可以检测细菌是否携带碳青霉烯酶基因，还可以结合测序技术确定耐药基因亚型，具有准确、灵敏、特异的优点。但该检测方法需要特殊的实验室场地和仪器，对人员要求高，无法检测出未知的碳青霉烯酶基因。PCR检测CRE的敏感性高达97%，明显高于显色培养筛选，与培养法比较，检测时间明显缩短（P＜0.000 1）[15]。

4 基于MALDI-TOF MS技术的筛查方法

MALDI-TOF MS技术在微生物鉴定中已日趋成熟，而且也可以用于检测CRE，其原理是将待测菌株与碳青霉烯类抗菌药物共同培养，采用MALDI-TOF MS技术检测培养上清液中碳青霉烯类抗菌药物的特征峰是否消失，从而判读待测菌株是否产碳青霉烯酶，灵敏度为96.67%、特异性为97.87%[16]。以不同碳青霉烯类抗菌药物作为底物，CRE的检出率也不同，以厄他培南为水解底物时，其检出率为100%；而以亚胺培南为水解底物时，其检出率为96.6%[17]。相关报道也证实了MALDI-TOF MS技术检测CRE与表型检测方法的符合率为100%，其中包括不同型别，如KPC型、VIM型和OXA-48型碳青霉烯酶[18]。

5 其他分子诊断方法

采用环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术检测KPC基因，可在68℃条件下特异性扩增KPC基因，其他β-内酰胺酶基因不产生非特异性扩增，灵敏度可达100 CFU/mL，是普通PCR的10倍，检测时间只需要25 min；该方法还可以直接检测各类样本中的耐药基因，如痰液、尿液、粪便和血液样本等[19]。另外一种基于实时荧光PCR的高灵敏度的检测方法为XpertCarba-R法，该方法可以同时检测KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48等多种耐药基因，检测正确率为97.6%，但需要特殊设备，且耗材成本较高[20]。

6 展望

随着国内外CRE的快速播散，给临床抗感染治疗带来了极大的挑战，各种CRE检测方法的开发、应用和普及，尤其是像MALDI-TOF MS等分子生物学快速检测方法的应用，可以快速检测耐药菌株，明确CRE，为临床感染性疾病的诊治及医院感染的控制争取宝贵时间。随着这些新技术、新方法的应用，相信在不久的将来，我国及世界CRE可以得到有效控制。