SARS-Cov-2核酸检测结果解读与临床应用

姜佳慧， 林源吉， 余道军

（1.浙江中医药大学第四临床医学院，浙江 杭州 310000；2.杭州百迈生物股份有限公司，浙江 杭州 310000）

新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）疫情早期阶段，在疾病的早期诊断、监测及各项实验室检测指标中，以严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）核酸检测应用最广，临床意义最大。本文对SARS-Cov-2核酸检测结果解读与临床应用进行综述，以期为临床诊断提供参考。

1 SARS-CoV-2核酸检测结果解读

到目前为止，我国国家卫生健康委已经发布了7版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》[1]，均将SARS-CoV-2核酸检测阳性作为COVID-19确诊的主要指标。SARS-CoV-2核酸检测的靶基因为ORF1ab基因、N基因和E基因，采用实时荧光定量聚合酶链反应快速扩增靶基因[2]，可在2 h内明确是否存在SARS-CoV-2。因此，检测SARS-CoV-2核酸作为实验室病原学诊断标准是合适的。但SARS-CoV-2核酸检测不能作为COVID-19实验室病原学诊断的“金标准”，真正的“金标准”应该是从患者标本中分离出SARS-CoV-2。我们对SARS-CoV-2的认识及其基因序列的获得都是基于从患者体内分离出病毒，并对其进行全基因测序，通过分析病毒基因组，筛选出病毒保守基因，然后开发出用于SARS-CoV-2核酸检测的诊断试剂。目前在用的SARS-CoV-2核酸检测试剂基本上都是基于这种模式。

虽然COVID-19病原学诊断的“金标准”是病毒分离，但由于病毒分离技术要求高、成功率相对较低，且速度慢，不能满足临床快速诊断及鉴别诊断的需要。而SARS-CoV-2核酸检测速度快、特异性高，因此，病原学诊断还是依赖于核酸检测，病毒分离技术主要用于科学研究和疫苗开发等领域。

2 用于SARS-Cov-2核酸检测的标本类型

可用于SARS-CoV-2核酸检测的标本种类较多，主要包括呼吸道标本、消化道标本和血液标本等。

2.1 呼吸道标本

目前临床上应用最多的标本是呼吸道标本，尤以鼻咽拭子最为普遍[1-2]。对于SARS-CoV-2核酸检测，下呼吸道标本（痰液或气道抽取物）结果更加准确[1]。但相对于气道抽取物，痰液标本采集较为方便，一般临床实验室主要用鼻拭子，辅以痰液标本。在检测SARS-CoV-2核酸时，有时会遇到鼻拭子检测阴性而痰液检测阳性的现象。虽然痰液标本SARS-CoV-2核酸检测阳性率高于鼻咽拭子，但临床应用最多的还是鼻咽拭子，原因主要有2个方面：一是鼻咽拭子采集较为方便、快捷，可以多次重复采样；二是SARSCoV-2感染患者临床表现多为干咳[3]，痰液较少，所以痰液标本采集困难。因鼻咽拭子中病毒载量相对有限，且对采样要求较高（需要采集到足够的呼吸道上皮细胞），故鼻咽拭子SARS-CoV-2核酸阳性率不高，且可能出现阴性、阳性交替出现的现象。

2.2 粪便标本

在COVID-19疫情早期，很少有人重视消化道标本的核酸检测，随着对疾病认识的加深，临床实验室越来越多地采集粪便或肛拭子检测SARSCoV-2核酸[4]，且阳性率也不低，甚至出现鼻咽拭子核酸阴性而粪便核酸阳性的现象。SARS-CoV-2主要与血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）-2受体结合[5]。有研究结果表明，ACE-2在肺部组织和小肠组织表达最丰富，且在几乎所有器官的内皮细胞和平滑肌细胞上的表达也很丰富[6]，SARS-CoV-2一旦进入肺部组织和肠道组织，会很快在组织内复制。因此，临床上检测SARS-CoV-2核酸，以呼吸道和消化道样本阳性为主。由于目前尚未见消化道感染致死的病例报道，因此SARS-CoV-2对消化系统的致病力是否与呼吸系统一致尚需进一步探讨。SARS-CoV-2可能主要通过呼吸-消化系统途径感染消化道。咽是呼吸和消化系统的共同通道，分别与鼻腔、口腔和喉腔相通，COVID-19患者呼吸不畅、气道受损，会通过口-鼻呼吸，或者在干咳、打喷嚏等过程中发生吞咽运动，此时从呼吸道排出的病毒会通过吞咽运动进入消化道，而肠道上皮细胞富含ACE-2受体，导致病毒二次感染消化道，因为是二次感染，其毒力相对较弱；另外，SARS-CoV-2对消化系统的毒力可能相对较弱，因此临床表现以呼吸系统症状为主，消化系统症状相对较轻。病毒在肠道内复制后，可以通过粪便被排出体外，因此，粪便SARS-CoV-2核酸检测会出现阳性结果。当然，还有一种可能，病毒在通过呼吸-消化途径进入肠道后，被胃肠道消化酶、盐酸等杀灭，但病毒核酸依然存在，通过肠道被排出体外。SARS-CoV-2是否在消化道被杀灭，既与进入消化系统的病毒载量密切相关，也与患者消化功能有关。不同患者粪便标本核酸检测结果差异很大，进入消化系统病毒载量大、消化功能相对较弱的患者的粪便核酸检测阳性率高，且可能存在时间相对较长，反之则阳性率低或存在时间短。

总之，SARS-CoV-2对消化系统的毒力远远小于呼吸系统。在治疗上，临床上主要针对呼吸系统进行救治，对于病毒所致的消化系统症状诸如腹泻等，不建议进行止泻治疗，建议以调节酸碱平衡和水液平衡，保持内环境稳定为主，通过腹泻将病毒排出体外，更利于缩短康复时间。

2.3 血液标本

采用血液标本检测SARS-CoV-2核酸存在一定争议，SARS-CoV-2不易进入血流，即使进入，病毒载量也很低，或存在时间很短。只有危重患者血管屏障遭受破坏或者血管通透性增加，SARS-CoV-2才能进入血流，导致病毒血症。但在病毒血症患者的血流中，病毒存在时间不长，因此采血时机很难把握。这导致血液标本SARS-CoV-2核酸检测阳性率很低，不适用于SARS-CoV-2核酸检测。

2.4 其他标本

目前还有眼部分泌物、空气等标本SARSCoV-2核酸检测阳性的报道，但此类报道仅为个例，且不排除标本被污染的可能。眼分泌物核酸阳性不排除患者手污染病毒后再接触眼睛导致眼部被感染的可能。空气中检测到SARSCoV-2核酸阳性，一般认为是感染者飞沫污染所致。因此，眼部分泌物、空气等标本检测SARSCoV-2核酸的临床意义不大。

3 病毒核酸检测假阴性、假阳性问题

在SARS-CoV-2核酸检测过程中，经常会出现临床表现高度疑似COVID-19，但核酸检测阴性的情况，因此有学者建议以影像学检查代替核酸检测。造成SARS-CoV-2核酸检测假阴性的因素很多，涉及分析前、中、后的每个环节，包括病程病情、标本采集、检测试剂盒、实验操作和仪器性能、结果解读等，其中尤以分析前（标本采集）因素最为显著。

3.1 分析前因素

分析前因素对检验结果的影响较大，标本采集、保存和运输等分析前因素难以把控。COVID-19患者临床表现以干咳为主，呼吸道分泌物相对较少，因此病毒黏附于鼻咽部位较少，且存在时间也较短，所以采样过程中如未严格按照规范采样，采样时间短、鼻咽拭子插入鼻腔深度不够、在鼻咽部擦拭力度不足、范围小、患者鼻咽部位暴露不充分（没有让患者头部后仰）等均可导致不同采样人员、不同采集时间送检的鼻咽拭子SARS-CoV-2核酸检测结果差异很大。

3.2 分析中因素

对于成熟的检验方法，分析中的影响因素已经很小，但SARS-CoV-2核酸检测分析中影响因素也不能忽视。

3.2.1 试剂盒因素 COVID-19是新发传染病，以往没有针对SARS-CoV-2的核酸检测试剂，2020年初获得病毒全基因序列后，分子诊断研发人员根据生物信息学理论筛选出SARSCoV-2保守序列，并基于理论上的保守序列短期内开发出SARS-CoV-2核酸检测试剂盒。因为COVID-19传染性极强，迫切需要快速诊断以行隔离或治疗处理。因此，我国相关部门通过绿色通道紧急审批了病毒核酸检测试剂，并立即投入临床检验。SARS-CoV-2核酸检测试剂是基于逆转录荧光定量PCR技术的3类分子诊断试剂，从立项研发到临床应用一般需要2～3年时间[7]，但由于SARS-CoV-2核酸检测试剂的临床验证病例数及应用时间不足，其准确性、稳定性、检测限、精密度等性能指标无法保证，因此，初期SARS-CoV-2核酸检测出现假阴性、假阳性也与试剂检测性能有关。目前，SARSCoV-2核酸检测试剂有ORF1ab基因、N基因、E基因3个检测靶基因，不同品牌试剂检测靶基因数目不同，大部分采用双靶点，但也有少数品牌采用单靶点或三靶点。对于2个或3个靶基因试剂出现单靶基因 “阳性”的情况，一般实验室会重新采集标本复检，只有2次结果一致且2个或3基因同时阳性，实验室才会出具阳性报告。所以，因试剂原因导致的假阳性比例极小。在疫情初期，临床实验室检测SARS-CoV-2核酸时，为避免因试剂原因造成的假阴性，一般采用2～3个不同品牌试剂进行平行检测，尽量保证检测结果的准确、可靠。随着SARSCoV-2核酸检测试剂的不断研发，检测结果假阴性问题已基本不会对COVID-19的诊治造成困扰。

3.2.2 实验操作 因SARS-CoV-2具有强传染性，检验人员在进行病毒核酸检测时，应在具有负压的二级生物安全实验室（P2+实验室）内进行实验操作。但疫情初期，大多医院没有配备负压实验室，病毒核酸检测一般只能在普通二级生物安全实验室进行，实验室人员做好三级生物安全防护[8]，这种情况对实验操作或多或少都有影响，不同的检验人员操作规范性不同，对检测结果会有一定影响。

3.2.3 仪器性能 随着检验技术的发展和管理的规范化，医学实验室一般都会对仪器进行性能验证，仪器性能对检验结果的影响相对很小。

3.3 分析后因素

临床实验室在报告SARS-CoV-2核酸检测阳性结果时，一般都会与临床充分沟通，保证阳性结果的可靠性。但是，对于病毒核酸检测阴性结果，实验室与临床的沟通不够充分，一般直接出阴性报告，可能会对检测结果的准确性产生一定的影响。

4 COVID-19出院标准中关于SARS-CoV-2核酸检测指标的应用

随着对疾病认识的加深，最新版诊疗方案规定患者呼吸道和粪便标本2次核酸检测阴性才可出院[1]。如能组建有检验专家参与的COVID-19患者出院专家组，不完全根据SARS-CoV-2核酸检测的阴、阳性结果决定是否可以出院，对COVID-19患者出院标准的把握会更为可靠。COVID-19出院患者复检核酸阳性，并不一定是复发，有可能是出院前2次核酸检测为假阴性结果。这类患者临床上可能已经真正痊愈，但是体内可能仍然存在少量病毒，此时行呼吸道标本核酸检测可能出现阴性结果，若采样不规范，或没有采集到足够量的标本，出现假阴性的概率相对较大。患者出院后，体内的病毒可能还会在体内复制，所以复检可能再次出现阳性结果。对于此类出院患者，只要未出现临床复发，仅仅病毒核酸阳性，在临床处置上应与初发COVID-19患者区别对待，建议临床上采取隔离观察，防止传染他人，如出现临床症状，再入定点医院进行治疗。粪便标本核酸检测的临床意义没有呼吸道标本大，且粪便核酸阳性不代表体内存在活病毒，建议粪便标本SARSCoV-2核酸检测作为辅助出院指标比较好，不宜作为硬性出院指标。

5 总结

SARS-CoV-2核酸检测的病原学确诊意义毋庸置疑，临床标本采集的规范性对检测结果的影响最为显著。SARS-CoV-2在体内存活的时间因患者免疫力的不同而有差异。COVID-19患者出院后SARS-CoV-2核酸检测结果“复阳”不一定是疾病复发，有可能与与核酸检测假阴性（标本采集原因）有关，对于此类患者应与初发患者区别对待。 非呼吸道标本SARS-CoV-2核酸检测临床意义相对较小，作为参考即可。临床实验室应发挥自身专业优势，正确解读相关检测结果，为临床提供科学、客观的实验室意见。